Um inibidor não competitivo é um inibidor que só se liga ao complexo enzimático-substrato. A formação do seu local de ligação só se forma quando a enzima e o substrato interagiram entre si. A inibição não competitiva não funciona quando substratos adicionais estão tentando ser envolvidos. O complexo enzima-substrato-inibidor não produz nenhum produto
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-> E + P
Inibidor não-competitivo liga-se ao complexo enzimático-substrato para impedir que a enzima reaja com o substrato para formar o produto, como tal, funciona bem em concentrações mais elevadas de substrato e enzimas que os substratos estão ligados às enzimas; a ligação resulta na diminuição da concentração de ligação do substrato à enzima, Km e Vmax, e no aumento da afinidade da ligação da enzima ao substrato.
E + I -> (através de S) ES + I -> E + P
onde E é a enzima, I é o inibidor, ES é o complexo enzimático-substrato, e P é o produto.
Esta ligação do substrato modifica a estrutura da enzima, tornando o local de ligação do inibidor disponível. A inibição não competitiva diminui a velocidade máxima, assim como o KM. K,M é a concentração do substrato quando a velocidade é metade da velocidade máxima com base no Modelo Cinético de Michaelis-Menten. Tanto o Vmax como o KM são reduzidos em quantidades iguais. O Vmax ainda será reduzido mesmo que a ligação enzimático-substrato seja aumentada porque existem complexos de ESI sendo formados. Os complexos de ESI inibem a formação do produto. Um inibidor não competitivo irá reduzir o KM e criar uma melhor ligação enzimático-substrato porque ele só se liga ao complexo ES. Mas o complexo ES está constantemente se esgotando à medida que o inibidor se liga, produzindo complexos de ESI. Portanto, para manter o equilíbrio entre os complexos ES e ESI e seguindo o Princípio de Le Chatelier, a reação se desloca para mais formação de ES onde se ligará mais substrato às enzimas para criar mais ES. Em última análise, isto leva a um KM mais baixo. Um KM reduzido indica uma melhor ligação enzimático-substrato porque a enzima pode atingir metade da sua velocidade máxima com menos concentração de substrato. De certa forma, a ligação enzimático-substrato é muito eficiente porque a enzima e o substrato têm uma alta afinidade e interagem fortemente.