Properties and Detection of Botulinum Neurotoxin
The clostridia produce more types of protein toxins than any other genus of microorganisms. A característica notável do Clostridium botulinum é a sua capacidade de sintetizar uma neurotoxina de extraordinária potência. BoNT’s compreendem uma família de toxinas farmacologicamente semelhantes que se ligam a sinapses colinérgicas periféricas e bloqueiam a exocitose de acetilcolina nas junções neuromusculares. As BoNTs são produzidas em alimentos, no intestino e em cultura como complexos de toxinas progenitoras que consistem em neurotoxinas botulínicas associadas a proteínas não tóxicas. Os componentes não tóxicos dos complexos têm sido demonstrados para dar estabilidade à neurotoxina e prevenir a inativação por enzimas digestivas no intestino.
O diagnóstico de botulismo é geralmente realizado pela avaliação dos sintomas clínicos em pacientes, e para surtos alimentares, na agregação de casos envolvendo um grupo de pessoas que comeram um alimento comum. Na maioria das investigações de botulismo, o objetivo principal é detectar a presença de BoNT, uma vez que esporos de C. botulinum estão disseminados no ambiente e contaminam muitos alimentos. A detecção de BoNT no sangue, no conteúdo gástrico e nos alimentos fornece a confirmação do botulismo. O isolamento de C. botulinum de um alimento suspeito, de fezes de lactentes com sintomas de botulismo ou de feridas fornece evidências de apoio para o diagnóstico de botulismo. No entanto, não fornece uma confirmação na maioria dos casos, já que esporos são encontrados em alimentos e ocasionalmente nas fezes de adultos saudáveis.
BoNT é detectado preferencialmente usando um bio-ensaio da toxina extraída de um alimento ou amostra clínica. O extrato é injetado intraperitonealmente em ratos e os animais são observados periodicamente para sinais típicos de botulismo por até quatro dias. Dependendo da quantidade de BoNT presente, os sintomas de botulismo são geralmente observados dentro de 4-24 h. Os sintomas característicos incluem a diminuição da mobilidade dos animais, o desprendimento do pêlo, dificuldade em respirar, contração dos músculos abdominais dando a morfologia da vespa, seguida de convulsões e morte. Os animais que demonstram estes sinais geralmente morrem entre 24-48 h. Os animais que morrem antes das 2 h ou depois das 48 h devem ser considerados como sucumbindo a outras substâncias que não a BoNT. A morte devido à ORL é confirmada pela neutralização com antitoxinas específicas do sorotipo.
Complicações são frequentemente encontradas no bioensaio da ORL em ratos a partir de amostras clínicas e de certos alimentos. Em particular, são comuns as mortes causadas por substâncias que não interferem com a botulinum. Estas fatalidades não-específicas podem geralmente ser evitadas diluindo a substância interferente letal até um ponto final onde a morte é causada pela BoNT mais potente. Ocasionalmente, mais de um serotipo de BoNT pode estar presente numa amostra a ser analisada, e a confirmação requereria neutralização por uma mistura de antitoxinas. Com alimentos ou amostras clínicas, podem ocorrer mortes não-botulínicas por infecção ou pela presença de endotoxinas. Os agentes infecciosos podem ser removidos por filtração de membrana ou pela adição de antibióticos ao extrato a ser testado. Os extratos contendo endotoxinas podem geralmente ser diluídos até um ponto final adequado, ou as endotoxinas podem ser removidas por adsorção. Com extratos de cepas não-proteolíticas de C. botulinum (grupo II), a toxicidade é aumentada pela ativação por uma protease, como a tripsina. Em alguns alimentos, a tripsina pode gerar peptídeos tóxicos e, portanto, a reação deve ser terminada pela adição de inibidor de tripsina de soja após 30-60 min.
Viable C. botulinum pode ser isolado de alimentos por enriquecimento em um meio de crescimento adequado, como caldo de carne-glicose cozida ou meios contendo peptonas, extrato de levedura e glicose. C. botulinum tem necessidades nutricionais complexas e requer um meio rico para o crescimento. Para isolamento, é frequentemente útil aquecer uma porção do alimento ou amostra clínica a 80° ou 60°C para seleccionar para esporos do grupo I e II C. botulinum, respectivamente. Ocasionalmente, 50% de etanol é usado para inativar células vegetativas em amostras de alimentos analisados para o grupo II C. botulinum. Após o enriquecimento, a presença de BoNT é testada pelo bioensaio em ratos, como descrito anteriormente. Ágares de isolamento seletivo contendo antibióticos, incluindo cicloserina, sulfametoxazol e trimetoprim, têm sido usados para o isolamento do grupo I C. botulinum de amostras clínicas.
Foi desenvolvida uma variedade de métodos imunológicos para a detecção de BoNT, mas a maioria não é tão sensível quanto o bioensaio em camundongos e também tem o inconveniente potencial de detectar BoNT biologicamente inativo. Vários avanços nos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) foram feitos para aliviar estes inconvenientes e é provável que o ELISA seja utilizado para complementar mas não substituir o bioensaio em ratos.