As eclusas do canal operam por gravidade a partir dos lagos Gatún, Alajuela, e Miraflores, que são alimentados pelos Chagres e outros rios. As eclusas em si são de comprimento, largura e profundidade uniformes e foram construídas em pares para permitir o trânsito simultâneo de embarcações em qualquer direção. Cada eclusa tem duas folhas, de 20 metros de largura e 2 metros de espessura, colocadas em dobradiças. Os portões variam em altura de 46 a 82 pés (14 a 25 metros); o seu movimento é alimentado por motores eléctricos encastrados nas paredes da eclusa. São operados a partir de uma torre de controle, que está localizada na parede que separa cada par de fechaduras e a partir da qual também é controlada a inundação ou esvaziamento das câmaras das fechaduras. As câmaras das eclusas têm 300 metros de comprimento, 33 metros de largura e 12 metros de profundidade.

Por causa da natureza delicada dos mecanismos originais das eclusas, apenas pequenas embarcações podem passar pelas eclusas sem assistência. As embarcações maiores são guiadas por locomotivas de reboque eléctricas, que operam sobre trilhos dentados nas paredes da eclusa e servem para manter os navios centrados na eclusa. Antes de se poder entrar numa eclusa, é necessário passar uma corrente de pára-lamas, esticada entre as paredes da aproximação. Se tudo estiver a decorrer correctamente, essa corrente será largada na sua ranhura no fundo do canal. Se por acaso a nave se mover demasiado rápido para segurança, a corrente permanecerá esticada e a nave correrá contra ela. A corrente, que é operada por máquinas hidráulicas nas paredes, então pagará lentamente pela liberação automática até que o navio tenha sido parado. Se a embarcação se afastar da locomotiva de reboque e, rompendo a corrente, bater na primeira porta, uma segunda porta a 50 pés (15 metros) de distância protegerá a eclusa e a detenção mais avançada.

Os sistemas da terceira eclusa do Projeto Terceiro Conjunto de Eclusas, iniciado em 2007, foram inspirados na eclusa Berendrecht em Antuérpia, Bélgica, e nas bacias economizadoras de água usadas em canais na Alemanha. Cerca de 190.000 toneladas de aço, a maioria proveniente do México, estão entrincheiradas em concreto fortemente armado para construir as câmaras das eclusas nos lados Atlântico e Pacífico, e as novas comportas medem até 10 metros de largura, 30 metros de altura e 58 metros de comprimento. As novas câmaras e bacias, que controlarão o fluxo de água do Lago Gatún, foram projetadas para minimizar a turbulência do fluxo de água e a perturbação das embarcações em trânsito. As bacias foram concluídas em junho de 2016 e incluem 158 válvulas compostas por 20.000 toneladas de material estrutural. As autoridades dizem que essas bacias economizadoras de água são as maiores do mundo e facilitam uma reutilização de 60 por cento da água. Enquanto as eclusas existentes utilizam 52 milhões de galões (197 milhões de litros) com cada utilização, as novas eclusas utilizam 48 milhões de galões (182 milhões de litros).