Depth of Field

A consequência da abertura numérica é que ela está directamente relacionada com a profundidade de campo (DOF). Para um determinado objectivo, olhando para uma amostra, existe um plano particular de foco perfeito. A profundidade de campo é, quão longe acima e abaixo desse plano o objetivo e a amostra podem estar e ainda ter tudo em foco.

O mesmo ocorre na fotografia tradicional, uma abertura muito pequena aumentará a profundidade de campo. Uma abertura numérica maior dará uma maior resolução, mas a profundidade de campo torna-se consideravelmente menor. Há uma distância acima do plano da amostra e uma distância abaixo do plano da amostra, e em qualquer lugar dentro deles, há essencialmente um foco perfeito. Assim que a objectiva e a amostra estão fora desse limite, a imagem começa a desfocar-se.

A isto chama-se profundidade de campo. A fórmula para a profundidade de campo é:

where:
“n” é o índice de refração do material entre a objetiva e a amostra
λ (lambda) é o comprimento de onda da luz
NA é a Abertura Numérica

Na maioria dos casos o material entre a objetiva e a amostra é ar, e “n” é igual a 1,00. Para água, seu índice de refração é 1,33, e o óleo de imersão especializado para microscopia é 1,52. Para uma objetiva de baixa ampliação, como uma 4X ou mesmo uma 10X, a profundidade típica de campo é de mais ou menos 3 a 5 microns. Nesse caso, se a amostra for muito plana, a focalização pode não ser necessária, ou pode ser necessário apenas uma vez. Em geral, as amostras variam em espessura e variam em planicidade, portanto a focalização é necessária.

Para uma ampliação de 20X, que pode ser uma abertura numérica de 0,6 a 0,8, a profundidade de campo cai para cerca de mais ou menos 500 nanômetros. Movendo-se em alta ampliação com imersão em óleo a uma abertura numérica de 1,47, a profundidade de campo cai drasticamente, e a profundidade de campo pode ser de mais ou menos 0,1 a 0,2 microns (100 – 200 nm). Isso é uma tolerância muito apertada. A 100 nanômetros ou 200 nanômetros, pequenas alterações na planicidade da amostra ou na altura da amostra, ou na precisão das guias da fase de movimento da amostra XY, tornarão difícil manter o foco. Para manter o foco nesta situação, um sistema de auto-foco contínuo de rastreamento a laser conectado a um estágio de foco com objetivo de alta largura de banda, como o DOF-5, é a maneira ideal de manter o foco nestas aplicações de alta abertura numérica e alta resolução.