Morte celular é crucial para a execução adequada de processos normais e fisiopatológicos e é onipresente nos sistemas biológicos.

As formas programadas de morte celular são responsáveis pela produção de padrões morfológicos durante o desenvolvimento, seleção negativa durante a imunidade, e a ‘raça de braços’ molecular que ocorre entre os genes viral e hospedeiro durante a infecção, bem como por danos aos tecidos que ocorrem com estressores ambientais como as genotoxinas.

Alterações dentro dessas vias de morte celular podem se manifestar como doença, incluindo câncer, distúrbios degenerativos e síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS). A capacidade das células tumorais de eludir a morte celular programada é uma marca registrada da maioria dos tipos de câncer.

Nos últimos anos tornou-se claro que apenas medir as marcas individuais das células moribundas, como fragmentação nuclear ou permeabilidade da membrana, não é suficiente para discriminar entre as diferentes vias de morte celular, que incluem apoptose, morte autofágica celular e necrose.

O que é necessário é uma avaliação multi-parâmetros da morte celular que revele os eventos mecanicistas que ocorrem ‘por trás dos bastidores’. De acordo com recomendações do Comitê de Nomenclatura sobre Morte Celular 2009, processos relacionados à morte celular (apoptose, necrose, autofagia) podem ser classificados de acordo com a aparência morfológica, critérios enzimológicos, aspectos funcionais e características imunológicas.

Morte celular em várias formas

Apoptose

Apoptose refere-se a um programa de suicídio celular dirigido pelo gênero. Uma grande variedade de proteínas celulares, incluindo receptores de superfície celular, proteases e componentes mitocondriais, regulam um delicado equilíbrio entre a sobrevivência celular e a morte por apoptose. As mutações dentro destas proteínas podem fazer pender o equilíbrio, resultando na sobrevivência descontrolada e na proliferação de células tumorais. Portanto, a descoberta de mecanismos de apoptose pode resultar em novas estratégias para explorar esta forma de morte celular para fins terapêuticos.

A apoptose é acompanhada por uma redução do volume celular, condensação nuclear, fragmentação do DNA, bolha da membrana plasmática e engolfamento por fagócitos. Além disso, a apoptose tipicamente envolve permeabilização da membrana mitocondrial, seguida pela ativação da cascata; entretanto, proteases não caspásicas podem ser ativadas alternativamente.

Necrose

Necrose foi historicamente considerada como uma forma passiva de morte celular. Entretanto, dados recentes sugerem que a necrose também pode ser uma forma alternativa de morte celular programada, cuja ativação pode ter consequências importantes, como a indução de uma resposta inflamatória. Necrose e apoptose são morfologicamente muito distintas. A necrose é acompanhada por um ganho no volume celular, inchaço das organelas, ruptura da membrana plasmática e perda de conteúdo intracelular.

Em relação à diferença entre apoptose e necrose, os vários métodos de distinção entre morte celular apoptótica e necrótica dependem de características que podem ser visualizadas e/ou medidas, tais como tamanho celular, fragmentação celular e clivagem de DNA.

Autofagia

Autofagia é um processo de degradação homeostática altamente regulado onde as células destroem os seus próprios componentes através das máquinas lisossómicas e reciclam-nos. Este processo está associado a diversas doenças, incluindo a doença de Alzheimer, envelhecimento, cancros e doença de Crohn. Em alguns casos, a autofagia elevada contribui para a morte celular através de um extenso crosstalk com vias de sinalização pró-apoptótica. A compreensão da correlação entre a autofagia e a morte celular apoptótica é o foco de muitas pesquisas, particularmente em biologia tumoral.

Autofagia vs Apoptose

Morte celular autofágica é morfologicamente definida como morte celular que ocorre na ausência de condensação de cromatina mas é acompanhada por vacuolização massiva do citoplasma. Em contraste à apoptose, a autofagia tem pouca ou nenhuma associação com fagócitos. Durante esta forma de morte celular, o material citoplasmático é sequestrado dentro dos autofagosomas para degradação pelos lisossomas.

Sabe-se agora que existe uma conversa cruzada entre a via apoptótica e a autofagia, e estudos têm mostrado que o BCL2, que é um importante regulador da apoptose, é também um importante regulador da via da autofagia.

Avanços recentes em biologia química, análise de vias e citometria sofisticada têm permitido uma compreensão mais profunda dos marcadores moleculares e das mudanças celulares que caracterizam cada via de morte celular. Além disso, a evolução da tecnologia também tornou possível a realização de muitas dessas avaliações como experimentos de rotina, em linha com as análises posteriores. Juntos, estes avanços transformaram o estudo da morte celular na dissecção de redes de sinalização nuances que são integradas em sistemas complexos.

Uma das características centrais da morte celular que a comunidade científica está tentando dissecar é o ponto de não retorno ao longo destas vias nuances. Existem pontos reversíveis e irreversíveis ao longo de cada via de sinalização de morte celular e determinar onde se encontra o ponto de transição dentro de vários contextos é de grande importância do ponto de vista da tentativa de intervir no processo. Independentemente do tipo de morte celular, uma vez que a célula tenha passado o ponto de não retorno, a morte não pode ser evitada.

Morte celular analizante

Para dissecar, caracterizar e diferenciar entre as várias formas de morte celular, dois tipos de critérios são necessários: descritivo (por exemplo, imagiologia) e funcional (por exemplo, inibição da via). Por exemplo, a fragmentação do DNA e a ativação da caspase podem ajudar a definir a apoptose, mas estas análises não são definitivas quando usadas isoladamente porque a apoptose pode ocorrer sem fragmentação do DNA, e a ativação da caspase também está ligada a outros processos biológicos.

Por isso, a morte celular deve ser sempre medida usando múltiplos métodos, de preferência na mesma amostra, combinando ensaios bioquímicos e morfológicos quando possível. Uma gama de tecnologias pode fornecer informações valiosas sobre as várias vias de morte celular, incluindo imagens, TUNEL, ensaios de base imunológica, citometria de fluxo, citometria baseada em imagens e tecnologias para imagens de células aderentes. Entretanto, há alguns inconvenientes comuns e inerentes aos métodos atuais de investigação da morte celular que podem limitar sua utilidade.

Por exemplo, tecnologias como Western Blotting e ELISA não são capazes de fornecer mudanças específicas por célula, embora sejam muito úteis para a coleta de informações sobre a mudança total no processo. Alguns métodos de imagem podem ter limitações sobre se um número equivalente de células é contado entre amostra a amostra, ou se um número suficiente de células é contado, o que poderia impactar a reprodutibilidade e/ou precisão dos resultados.

Na outra extremidade, métodos como a citometria de fluxo multiparamétrico ou a citometria de imagem podem ser muito poderosos e fornecer dados ricos em conteúdo para análises de morte celular, mas esses métodos também podem ter limitações. Por exemplo, o acesso à instrumentação pode ser limitado, pode haver a necessidade de muita experiência e treinamento, e a acessibilidade pode ser um desafio.

Há uma necessidade na indústria de metodologias fáceis de usar, acessíveis e de baixo custo que possam fornecer respostas robustas, precisas e reproduzíveis às perguntas comuns e cotidianas que os pesquisadores estão investigando sobre a saúde e a morte celular. Os métodos estabelecidos e emergentes para discriminar eficazmente entre apoptose, necrose e autofagia são descritos abaixo.

Imaging

Morte celular é, em última análise, um processo morfológico e o padrão ouro para analisar este processo é visualizar as células. Quando a morte celular é testemunhada em cultura, torna-se muito óbvio o que está ocorrendo. Por exemplo, durante a apoptose, as células se reúnem e parecem ferver (“blebbing”). Existem múltiplas abordagens disponíveis para a morte celular por imagem, incluindo a simples visualização das células em tempo real em cultura, coloração das células com acridina laranja (um corante vital específico para células apoptóticas), coloração histológica de tecido fixo e microscopia electrónica. Há também novas opções disponíveis na citometria de imagem, como descrito mais abaixo.

Terminal Deoxinucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

O procedimento Terminal Deoxinucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) é um método muito comum para examinar a fragmentação de DNA que resulta da apoptose. TUNEL rotula as extremidades terminais do DNA que são clivadas na região do espaçador entre os nucleossomos na cromatina, e estas quebras de fios de DNA são visualizadas por microscopia leve. Embora o TUNEL seja um ensaio muito eficaz para a apoptose, uma grande limitação desta abordagem é que o TUNEL detecta células apoptóticas no último estágio do processo.

Activação de caspase

A nível molecular, uma série de enzimas conhecidas como caspases são largamente responsáveis pela execução da via apoptótica, mas não necrótica, da morte celular. Em resposta a sinais pró-apoptóticos, as caspases participam de uma série de reações que resultam na clivagem de substratos proteicos, causando a desmontagem da célula. As caspases existem em todas as células do corpo como proenzimas adormecidas. Durante a apoptose, as caspases formam moléculas de tetrâmeros enzimáticos activos que podem activar ou inactivar os seus substratos.

Estas enzimas reconhecem especificamente uma sequência de quatro ou cinco aminoácidos no substrato alvo, que inclui um resíduo de ácido aspártico como alvo para a clivagem. As caspases funcionam em outros processos biológicos, como a imunidade; de fato, muitos genomas virais codificam para inibidores diretos dessas caspases. As caspases podem ser detectadas através de técnicas de imunoprecipitação ou immunoblotting usando anticorpos específicos das caspases, ou utilizando substratos fluorocromáticos que se tornam fluorescentes após a clivagem pela caspase. Adicionalmente, o envolvimento das caspases pode ser visualizado através do tratamento de culturas vivas com Smac mimetic, um potente indutor de apoptose.

Detecção mitocondrial

Mitocôndrias são reguladores chave de processos de morte celular como a apoptose. A perda do potencial transmembrana interna mitocondrial é freqüentemente, mas nem sempre, observada como associada aos estágios iniciais da apoptose e acredita-se que tenha um papel na morte celular independente da caspas. Os ensaios baseados em fluorescência, concebidos para avaliar o estado funcional das mitocôndrias, são ferramentas úteis para examinar o papel da atividade mitocondrial na cascata da apoptose.

Fosfatidilserina e anexina V

Fosfatidilserina (PS), confinada ao folheto da membrana interna das células viáveis, transloca para a superfície da membrana exposta durante os estágios iniciais da apoptose. Este evento serve como um sinal para as células fagocitárias atacarem. A PS é exposta principalmente nas bolhas de superfície das células apoptóticas. A anexina V tem uma alta afinidade com as membranas que contêm a PS carregada negativamente. Estes eventos podem ser visualizados usando citometria de fluxo.

Citometria de fluxo

Os ensaios de citometria de fluxo para apoptose têm agora quase 25 anos de idade. Os primeiros ensaios de citometria de fluxo para apoptose analisaram alterações na dispersão para frente e para o lado e fragmentação do DNA após o tratamento com etanol. Os ensaios de citometria de fluxo agora são realizados em quase todos os estágios da apoptose, desde as primeiras alterações mitocondriais até a ativação da caspase, alterações de membrana e danos no DNA. Ao contrário dos ensaios anteriores, a citometria de fluxo analisa a apoptose em células individuais.

Citometria de fluxo multiparamétrica é uma abordagem ideal para combinar múltiplos ensaios de morte celular. A detecção de FLICA caspase, a anexina V e um corante de ligação de DNA imune a células (por exemplo, iodeto de propidium) podem ser combinados em um poderoso ensaio de apoptose em várias etapas (Figura 1).

Combinando estes ensaios, é possível analisar a progressão da apoptose e fornece uma imagem muito mais rica do que qualquer ensaio sozinho pode fornecer.

Uma plataforma de citometria de fluxo de bancada também pode fornecer informações celulares quantitativas instantaneamente para muitas análises de saúde celular, morte celular, sinalização celular, imunologia e ciclo celular. Um desses instrumentos utiliza os princípios da citometria microcapilar, que permite a análise de amostras de tamanho pequeno. A plataforma é fechada, onde os reagentes e o software são estreitamente emparelhados para aplicações dedicadas, a fim de simplificar o processo e reduzir a complexidade analítica para realizar e obter dados baseados na citometria.

A tecnologia permite a análise de dois marcadores simultaneamente e pode ser usada para realizar estudos de resposta de tempo e dose, fornecendo assim uma visão mais profunda dos mecanismos em jogo, bem como um quadro mais abrangente do processo de morte celular (Figura 2).

Até à data, existe apenas um ensaio de citometria de fluxo disponível para analisar a autofagia, que envolve a medição da cadeia luminosa 3 (LC3). A LC3 é uma proteína que segrega os autofagosomas que são mitocôndrias defunctoras fagocitárias e outras organelas intracelulares e eventualmente em lisossomas. A autofagia pode ser detectada por citometria de fluxo usando a proteína fluorescente verde (GFP)-LC3 translocação (Figura 3).

Neste ensaio, uma linha celular é transfectada de forma estável com GFP-LC3. Durante a indução, um inibidor de lisozima é adicionado para bloquear a destruição de auto-fagosomas por lisossomas. Se a autofagia ocorrer, o GFP-LC3 se acumula nos autofagosomas quando o inibidor está presente e não será liberado na mídia. Se a autofagia não ocorrer, então o GFP-LC3 se acumulará no citoplasma e será liberado na mídia. A GFP-LC3 associada ao autofagostoma pode ser detectada nas células intactas por citometria de fluxo.

Citometria de imagem

Citometria de imagem permite a coleta simultânea de dados citométricos e imagens de células correlacionadas, e muitas opções agora existem para estes tipos de análises. Como a apoptose é altamente variável e pleiotrópica, a imagem pode fornecer a verificação de que a apoptose está ocorrendo e também pode caracterizar o processo até certo ponto através da visualização da condensação de cromatina e da quebra do citoesqueleto. A citometria de imagem também fornece opções adicionais de análise, incluindo análise pixel a pixel, que são úteis para a análise apoptótica. Além disso, o descolamento Trypsin ou Accutase®, que pode ‘lamacento’ etiquetas apoptóticas, não é necessário.

Citometria de imagem também permite a análise das células aderentes sem remoção das células do seu substrato. Por este motivo, muitos laboratórios utilizam a citometria de imagem para a análise de células apoptóticas aderentes. As células aderentes que são arrancadas do seu substrato, seja por raspagem ou por tripsina, podem perturbar o fenótipo apoptótico, ou mesmo induzir o próprio processo apoptótico. A citometria de imagem permite que as células aderentes permaneçam aderentes durante toda a análise através da coloração das células diretamente na lâmina da câmara. É importante notar que as células aderentes irão se arredondar assim que passarem pela apoptose, assim algumas das células que estão nos estágios finais da apoptose podem ser perdidas.

Um sistema de citometria de imagem baseado em fluxo também fornece correlação direta entre a citometria e a imagem, e assim combina análise citométrica e morfológica. Em um sistema de imagem baseado em fluxo, as células não são imitadas em uma lâmina; ao contrário, são imitadas diretamente no fluxo. Quando a citometria e as imagens estão correlacionadas, células apoptóticas em estágio inicial, intermediário e tardio podem ser agrupadas e analisadas (Figura 4).

Conclusão – Morte Celular: Discriminando entre apoptose, necrose & autofagia

A morte celular é um processo natural essencial para muitas funções fisiológicas normais, tanto para o desenvolvimento como para a homeostase. Além disso, alterações nas vias de sinalização da morte celular estão associadas a várias doenças. A medida das marcas individuais das células que morrem não é suficiente para discriminar entre as diferentes vias de morte celular, que incluem apoptose, necrose e autofagia; em vez disso, é necessária uma avaliação multi-parâmetros que inclua tanto critérios descritivos como funcionais.

Avanços recentes na tecnologia permitem agora uma visão mais profunda dos marcadores moleculares e das mudanças celulares que caracterizam cada via de morte celular, e também tornaram possível conduzir muitas dessas análises como experimentos de rotina. DDW

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Este artigo foi originalmente apresentado na edição do DDW Winter 2014 do DDW

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O Dr. John Abrams é professor de biologia celular; sua pesquisa examina as redes moleculares in vivo envolvidas na regulação da morte celular e explora os determinantes da organização da cromatina. Ele entrou para o University of Texas Southwestern Medical Center em 1994 e tornou-se presidente do programa de pós-graduação em genética e desenvolvimento em 2004. O Dr. Abrams completou o seu doutoramento na Universidade de Stanford.

O Dr. William G. Telford tornou-se cientista do National Cancer Institute nos National Institutes of Health em 1999, e é o diretor do laboratório central de citometria de fluxo no NCI Experimental Transplantation and Immunology Branch. Ele recebeu um PhD em microbiologia na Michigan State University e completou o pós-doutorado em imunologia na University of Michigan Medical School.

Louise Rollins é gerente de produto na EMD Millipore Corporation onde ela apoia o desenvolvimento do Muse® Cell Analyzer, um mini-ciclômetro de fluxo e seus kits de ensaio e módulos de software específicos para a análise de rotina da saúde celular e morte celular.