Abstract

Este estudo investiga o mecanismo subjacente ao efeito da melhoria da fertilidade do zinco em ratos obesos usando proteômica. Foram estudados os efeitos de três doses diferentes de ZnSO4 sobre a espermatogênese e os níveis hormonais. A espermatogênese testicular foi observada pela coloração HE. Os níveis séricos de estrogênio e testosterona foram medidos por imunoensaio de micropartículas quimioluminescentes. A análise proteômica dos espermatozóides foi realizada por cromatografia líquida – espectrometria de massa. O banco de dados DAVID foi usado para realizar a análise de enriquecimento GO e a análise do caminho do KEGG dos genes diferencialmente expressos, e o banco de dados online STRING foi usado para construir uma rede PPI. A contagem de esperma, a motilidade do esperma e os hormônios da testosterona do grupo dos ratos tratados com ZnSO4 foram aumentados. O ZnSO4 melhorou a estrutura testicular e as anormalidades de espermatogênese causadas pela obesidade. A análise proteómica mostrou que existiam 401 proteínas expressas de forma diferente num total de 6 amostras de esperma do grupo tratado com ZnSO4 e dos grupos obesos. As proteínas diferenciais foram introduzidas no site da DAVID. As 341 proteínas identificadas foram então classificadas de acordo com suas funções biológicas. A análise do KEGG mostrou que as vias do sinal enriquecido incluíram glicólise/gluconeogênese, metabolismo do carbono, ciclo do citrato, metabolismo dos ácidos graxos e metabolismo piruvado. Algumas proteínas mostraram estar associadas às vias de degradação valina, leucina e isoleucina. A análise de STRING obteve 36 proteínas de nós. A análise Cytoscape mostrou que essas proteínas participaram principalmente de nove redes, incluindo processo metabólico, oxidação-redução, respiração aeróbica, emenda de RNA e conjugação de glutationa. ZnSO4 pode melhorar a fertilidade de ratos machos obesos regulando a expressão de proteínas relacionadas ao metabolismo, inflamação e maturação dos espermatozóides.

1. Introdução

Obesidade está associada à infertilidade masculina. Existe uma certa consistência temporal entre o aumento da taxa de infertilidade masculina, a diminuição da qualidade do sémen e o aumento da taxa de obesidade. A obesidade leva a alterações patológicas na ultraestrutura testicular, e a apoptose das células espermatogênicas é significativamente aumentada . A diminuição do número de espermatogênicos maduros pode ser uma das razões que levam à baixa capacidade espermatogênica de pessoas obesas.

Existem distúrbios do metabolismo de elementos vestigiais em pessoas obesas. O nível perturbado do metabolismo dos oligoelementos no organismo induzirá efeitos correspondentes no metabolismo dos lípidos. No sistema reprodutivo masculino, os íons de zinco são distribuídos principalmente nos testículos, epidídimo, próstata e sêmen. O zinco é um marcador da função da próstata. Além disso, regula a função dos espermatozóides, actua como co-factor para a maioria das reacções enzimáticas e ajuda a manter a motilidade dos espermatozóides. O zinco também desempenha um papel importante no desenvolvimento testicular e na formação dos espermatozóides. A deficiência de zinco aumenta significativamente a apoptose das células germinativas nos testículos de camundongos e provoca a paragem da espermatogénese e danos na fertilização. Estudos demonstraram que homens obesos têm 3,5 vezes mais probabilidade de ter oligozoospermia do que homens com peso normal . A suplementação com zinco pode reduzir o peso de pessoas obesas. A glicemia (glicemia em jejum), os parâmetros lipídicos no sangue (colesterol total, triglicéridos, colesterol lipoproteico de alta densidade e colesterol lipoproteico de baixa densidade) e a pressão arterial melhoram após a suplementação com zinco . A preparação oral de zinco pode melhorar o conteúdo de zinco no plasma seminal, promover a transformação da proteína nuclear do esperma (isto é, da lisina para a arginina) e inibir a despolimerização prematura do núcleo do esperma. Pode melhorar a motilidade espermática e a qualidade do sémen de pacientes inférteis sem efeitos secundários óbvios. Entretanto, a aplicação da proteômica na compreensão dos efeitos do tratamento com ZnSO4 sobre as proteínas espermáticas na obesidade ainda é limitada e é necessária uma maior exploração.

Neste estudo, foram investigados os efeitos de três doses diferentes de ZnSO4 sobre a espermatogênese e os níveis hormonais de ratos obesos. O mecanismo subjacente a este efeito foi analisado mais detalhadamente pela análise proteômica.

2. Materiais e Métodos

2,1. Animais

Os ratos Sprague Dawley de 7 semanas (pesando 180-200 g) foram adquiridos do Centro Experimental Animal da Universidade Médica de Hebei. Eles foram mantidos em um ciclo de 12 h escuro/luz em uma sala com ar controlado (temperatura, ; umidade, ) com livre acesso à água e à comida animal. Todos os procedimentos de experimentação animal foram aprovados pelo Comitê de Ética do Instituto Hebei de Ciência e Tecnologia de Planejamento Familiar.

2,2. Estabelecimento do Modelo de Obesidade, Agrupamento Animal e Amostragem

Os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos: grupo alimentação normal (15 animais por grupo) e grupo modelo de obesidade (30 animais por grupo). Cada grupo foi alimentado com as dietas correspondentes durante 8 semanas, ou seja, uma dieta normal para o grupo normal e uma dieta rica em gorduras para o grupo modelo de obesidade. Os pesos corporais dos ratos foram pesados semanalmente e registrados por 8 semanas. O modelo de obesidade foi considerado bem-sucedido quando o peso corporal médio do grupo modelo foi 1,2 vezes maior do que o do grupo controle. O comprimento dos ratos foi medido (ponta do nariz até o ânus), e o índice de Lee foi calculado pela fórmula .

Após o estabelecimento do modelo de obesidade, os ratos modelo foram divididos aleatoriamente em dois grupos: o grupo obesidade e o grupo tratado com ZnSO4. Os ratos do grupo tratado com ZnSO4 receberam ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) por 4 semanas por gavagem oral. No final da experiência, foram medidos os pesos corporais, peso testicular, peso epidídimal e gordura peritesticular de cada grupo, e o sangue foi retirado da aorta abdominal. As amostras de esperma foram colhidas da epidídimoplastia caudal. Os testículos foram retirados.

2,3. Contagem de Esperma e Motilidade de Esperma

O epidídimo esquerdo de cada rato foi colhido imediatamente após o sacrifício e transferido para um tubo contendo 1 mL de soro fisiológico quente (37°C). Eles foram então agitados a 37°C por 5 min para permitir a dispersão dos espermatozóides. Aproximadamente 10 μL de suspensão de esperma diluído foram transferidos para cada câmara de contagem do hemocitômetro para determinar a concentração e a motilidade do esperma. A motilidade foi medida como a percentagem de espermatozóides móveis (grau a+b) entre os espermatozóides totais.

2,4. Determinação da Glicose no Soro de Jejum, Lipídios Sanguíneos e Insulina

Colesteróis totais, triglicéridos, lipoproteínas de baixa densidade e lipoproteínas de alta densidade no soro foram medidos em um analisador Siemens Centaur XP por um kit de imunoensaio de micropartículas quimioluminescentes (Medical System Biotechnology Co., LTD). A glucose no soro de jejum foi medida por um kit de detecção de glucose (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China) num analisador ACCUTE TBA-40FR (Toshiba Medical Systems Co., Tóquio, Japão). Os níveis séricos de insulina foram determinados por imunoensaio de quimioluminescência num sistema UniCel DxI 800 (Beckman Coulter, CA, EUA) com reagentes correspondentes (Beckman Coulter, CA, EUA).

2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Leptin level was determined by ELISA kits (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, China). Após o término da reação, a absorvância foi lida a 450 nm.

2.6. HE Staining

Os testículos foram fixados na solução de Bouin durante a noite. Os testículos foram então desidratados com álcool e embebidos em parafina. As amostras foram seccionadas em 5 μm de espessura e coradas com a coloração HE. A espermatogênese dos testículos foi observada sob um microscópio de luz.

2,7. Medição de Androgen Hormones

Níveis de estrogênio sérico e testosterona foram medidos em um analisador Siemens Centaur XP por imunoensaio de micropartículas quimioluminescentes. O kit de detecção foi adquirido da Siemens Healthcare Diagnostic Inc. e Cayman Chemical, Michigan, EUA.

2.8. Cromatografia Líquida – Espectrometria de Massa

As amostras de proteína espermática utilizadas neste estudo foram dos três grupos (grupo normal, grupo modelo de obesidade, e grupo tratado com ZnSO4). As amostras de espermatozóides foram colhidas do epidídimo caudal. Em resumo, as proteínas foram extraídas com tampão lisado com uréia 8 M, TDT 10 mM e inibidor de protease. A sonicação foi realizada por 3-5 min. O sobrenadante foi coletado após 20000 g de centrifugação por 10 min a 4°C, e a proteína foi quantificada com o método de Bradford. As proteínas extraídas foram incubadas com 100 mM TEAB a 100 μL e depois com 200 mM TCEP a 55°C durante 1 h. Depois disso, 5 μL de 375 mM iodoacetamida (IAA) foi adicionado. Após incubação no escuro por 30 min, foi adicionada acetona pré-resfriada e foi incubada durante a noite a -20°C. O sobrenadante foi removido cuidadosamente após 8000 g de centrifugação a 10°C durante 10 min, e o lisado foi deixado à temperatura ambiente durante 2-3 min para secar. Finalmente, 100 μg de proteína, 100 μL de solução de 100 mM de TEAB, e proteína da razão enzimática da tripsina (1 : 50) foram misturados e a digestão enzimática foi feita durante a noite a 37°C.

Cromatografia líquida – espectrometria de massa: amostras parcialmente digeridas foram colhidas e dissolvidas na solução A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA). Após centrifugação a 20000 g durante 30 minutos, o sobrenadante foi tomado e a sequência de proteínas foi detectada pelo espectrômetro de massa líquida EASY-nLC fase-Q Exactive (American Thermo Fisher).

Mass spectrometry conditions were 90 min for data acquisition time, 2 kV for spray voltage, 320°C for capillary temperature, 27% for normalized collision energy, and 300-1400 Da for collection mass range. Os parâmetros primários foram 70000 para resolução, 36 para o alvo AGC, 60 ms para TI máxima, e perfil para o tipo de dados do espectro. Os parâmetros secundários foram 17500 para resolução, 54 para o alvo AGC, 80 ms para TI máximo e 3,0 m/z para janela de isolamento.

2,9. Recuperação de dados

No motor de busca MaxQuant 1.5.2.8, o primeiro erro é 20 ppm, o segundo erro é 0.02 Da. A modificação fixa é a seguinte. A cisteína é modificada para Carbamidometil-Cys, e a modificação variável é a seguinte: Oxidação-M, LysisC ou Trypsin, ou digestão de Glu-C. A digestão enzimática permite até 2 locais em falta. O preenchimento de lacunas de dados, normalização e triagem de diferenças () foram todos realizados utilizando as configurações padrão do software Perseus. Um total de 1344 proteínas foram identificadas e quantificadas em 6 amostras de ambos os grupos. Foram obtidas informações qualitativas e quantitativas dos grupos Zn e G sobre as proteínas diferenciais. Foi realizado o software Perseus – teste e análise de significância sobre os resultados quantitativos e proporções de proteínas. A lista de proteínas diferenciais obtidas é a seguinte: um total de 401 proteínas diferenciais significativas foram obtidas pelos resultados -teste e resultados da análise de distribuição diferencial.

2,10. GO (Gene Ontology) e KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Analysis

Proteína diferencial foi importada para o site DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) (https://david.ncifcrf.gov/) para extração de bioinformática básica. As ferramentas web fornecidas pelo DAVID foram usadas para buscar termos e caminhos de anotação funcional que foram enriquecidos nas proteínas acima identificadas, incluindo componente celular, função molecular e processo biológico.

2,11. Análise da Rede de Interação Proteica

As proteínas diferenciais rastreadas foram importadas para a base de dados online STRING (https://string-db.org/) para análise. O mapa da rede de interação de genes diferenciais foi desenhado. Os dados da rede interativa foram exportados para o software Cytoscape 3.2 para determinar a proteína do nó central da rede.

2.12. Análise estatística

Os dados foram exibidos como . A análise estatística foi realizada no SPSS22.0 usando análise de variância unidirecional (ANOVA) com um valor < 0,05 considerado estatisticamente significativo.

3. Resultados

3,1. Parâmetros do Sêmen e Alterações do Nível de Hormônio Testosterona no Esperma após Tratamento com ZnSO4

Comparado com o grupo controle, o peso corporal, gordura peritesticular, índice de Lee, colesteróis totais, triglicerídeos, lipoproteínas de alta densidade e leptina de ratos do grupo obesidade e leptina de ratos do grupo tratado com ZnSO4 aumentou significativamente. Em comparação com o grupo controle, a lipoproteína de baixa densidade de ratos do grupo obesidade diminuiu significativamente. Em comparação com o grupo obesidade, o peso corporal, a gordura peritesticular e o índice de Lee diminuiu no grupo tratado com ZnSO4, e a diferença foi estatisticamente significativa (Tabela 1). A fim de detectar os efeitos do ZnSO4 na fertilidade dos ratos, cada grupo de parâmetros de sêmen foi primeiramente avaliado de acordo com os critérios da OMS 2010. O número de espermatozóides e a motilidade espermática foram inibidos no grupo da obesidade, como mostra a Tabela 2. Em comparação com o grupo obesidade, a contagem de esperma e a motilidade espermática dos ratos tratados com ZnSO4 aumentou, sugerindo que o ZnSO4 melhora os parâmetros de sêmen em ratos obesos. A própria obesidade pode causar um aumento dos lipídios no sangue, mas nossos resultados mostraram que a glicemia, os lipídios no sangue e os níveis de insulina não atingiram o nível de diabetes. Pode-se considerar que os fatores de confusão das complicações diabéticas foram excluídos. Além disso, detectamos o nível sérico de testosterona. Os resultados mostraram que as hormonas da testosterona aumentaram no grupo tratado com ZnSO4 em comparação com o grupo obeso (Tabela 2). Assim, o tratamento com ZnSO4 poderia melhorar a qualidade do sémen de ratos obesos.

3.2. Tratamento ZnSO4 Melhora a Recuperação da Deficiência Testicular Induzida pela Obesidade

Subseqüentemente, realizamos análise histológica do tecido testicular e os resultados foram mostrados na Figura 1. Segundo a histologia dos testículos, o grupo normal apresentou espermatogênese normal (Figuras 1(a) e 1(d)), enquanto que o grupo obeso apresentou espermatogênese perturbada, pois a luz do túbulo seminífero estava quase vazia (Figuras 1(b) e 1(e)). Como esperávamos, o grupo tratado com ZnSO4 mostrou melhora significativa em relação ao grupo obeso na histologia dos testículos com o aparecimento de células normais de Sertoli e Leydig e espermatogênese ininterrupta (Figuras 1(c) e 1(f)). Assim, ZnSO4 pode melhorar a estrutura testicular e anormalidades da espermatogênese causadas pela obesidade.

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Figura 1

Morfologia da secção transversal dos testículos para cada grupo com ampliação (a-c) 40x e (d-f) 100x por coloração HE: (a, d) grupo normal, (b, e) grupo obesidade, e (c, f) grupo tratado com ZnSO4.

3.3. Classificação de 341 Proteínas de Espermatozóides por Bioinformática: Componente Celular, Função Molecular e Processo Biológico

Para determinar as proteínas diferencialmente expressas, foi realizada análise proteômica. Um total de 1344 proteínas foram identificadas e quantificadas num total de 6 amostras de esperma do grupo tratado com ZnSO4 e do grupo obesidade. Foi realizado o software Perseus – análise de significância diferencial e de teste sobre os resultados quantitativos e proporções de proteínas. Foram obtidas um total de 401 proteínas significativas. As proteínas diferenciais foram introduzidas no site do DAVID para o grupo tratado com ZnSO4 e para o grupo obesidade, diferenças na função protéica. Na classificação GO, foram analisadas 371 proteínas e 30 proteínas não corresponderam. As 341 proteínas identificadas foram então classificadas de acordo com suas funções biológicas. Utilizamos as ferramentas da web fornecidas pelo DAVID para buscar termos e caminhos de anotação funcional que foram enriquecidos com as proteínas acima identificadas. Os resultados destas análises foram mostrados na Figura 2. Focamos a ontologia do componente celular, função molecular e processo biológico para análise de enriquecimento de termos de anotação funcional com e .

(a)

(b)

(c)

(d)

(a)
(b)(c)
(d)

No grupo “componente celular” (Figura 2(a)), a análise de categoria mostrou que 59% das proteínas com diferenças significativas eram componentes organeleicos, e 60,7% dessas eram constituintes organeleicos. Além disso, 29,6% das proteínas pertenciam a um complexo macromolecular. A análise do termo “função molecular” GO revelou que 22% das proteínas foram classificadas como proteínas com atividade catalítica (Figura 2(b)). As outras proteínas poderiam ser classificadas como ligação protéica, ligação rRNA e ligação enzimática. Em termos da base de dados do “processo biológico” (Figura 2(c)), a maioria das 24% das proteínas foram associadas ao processo metabólico. Além disso, as proteínas estavam ligadas ao transporte, transdução de sinal, morte celular, adesão celular, processo do sistema imunológico e reprodução. Os resultados da análise do caminho do sinal (Figura 2(d)) com proteína concentrada e enriquecimento são os seguintes. Vias metabólicas múltiplas como glicólise/gluconeogênese, metabolismo do carbono, ciclo do citrato (ciclo TCA), metabolismo dos ácidos graxos e metabolismo dos piruvatos foram perturbadas e afetadas, e algumas proteínas mostraram estar associadas a vias de degradação valina, leucina e isoleucina.

3,4. Os efeitos do zinco são ainda mais identificados pelas proteínas espermáticas expressas diferencialmente

Análise de quantificação foi realizada para comparar os níveis proteicos entre os três grupos. Nas proteínas diferenciais, foram selecionadas proteínas metabólicas, proteínas associadas ao transporte do zinco e proteínas dos nós na rede (Tabela 3). As proteínas com alterações estatisticamente significativas foram mostradas na Figura 3. Essas proteínas foram ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR e TM165. Em comparação com o grupo obesidade, a expressão de ARG2, COX5B e ZNT1 no grupo tratado com ZnSO4 foi significativamente reduzida, enquanto a expressão de LYAR e TM165 foi significativamente aumentada.

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3.5. A Differential Protein Interaction Network Is Established Using the STRING Network Database

STRING é um software de análise online que analisa e prevê a interação entre proteínas conhecidas. O software STRING estabelece um mecanismo de pontuação para fazer pesos correspondentes em diferentes fontes de dados e finalmente dá uma pontuação abrangente e depois constrói um mapa de rede de interações proteína-proteína . As 341 proteínas diferenciais rastreadas foram importadas para STRING (http://string-db.org/) banco de dados online para análise, e 341 proteínas foram identificadas, e o mapa de rede de interação diferencial de genes foi gerado. Depois disso, os dados da rede interativa foram exportados para o software Cytoscape 3.2 para determinar a proteína do nó central da rede. Pode-se observar que a rede de composição das proteínas diferenciais é complexa (Figura 4). Em seguida, utilizamos o plugin Cytoscape para analisar as proteínas dos nós da rede, e um total de 36 proteínas dos nós foram obtidas a partir da análise (Tabela 3). A partir de uma lista das principais redes geradas usando STRING, selecionamos as subredes. A análise do Cytoscape mostrou que essas proteínas participaram principalmente de nove redes incluindo processo metabólico, oxidação-redução, respiração aeróbica, emenda de RNA e conjugação de glutationa.

Figura 4

STRING rede de interação protéica. O círculo representa o gene e a linha representa a relação entre os genes.

4. Discussão

A OMS define uma pessoa com acúmulo anormal ou excessivo de gordura como sobrepeso ou obeso, e este estado constitui uma ameaça crescente para a saúde das pessoas globalmente . Alguns relatórios mostram que a taxa de obesidade está aumentando rapidamente , o que não só aumenta o risco de doenças, mas também, paralelamente, aumenta o risco dos pacientes de desenvolverem distúrbios reprodutivos. À medida que a função reprodutiva dos homens se deteriora globalmente, mais e mais pessoas têm percebido que a obesidade diminuiu a qualidade do sémen. Com o aumento do IMC, os parâmetros do sémen são alterados, alterando assim a estrutura física e molecular dos espermatozóides. Estudos anteriores descobriram que a concentração de esperma e a contagem total de espermatozóides móveis eram negativamente afectadas por um IMC elevado. No presente estudo, os ratos dos grupos obesos mostraram uma diminuição significativa da concentração de esperma e da motilidade espermática do esperma em comparação com os do grupo de peso normal, enquanto que o ZnSO4 melhorou os parâmetros de sémen em comparação com o grupo obesidade.

Os desequilíbrios nos hormônios sexuais podem afetar a reprodução masculina, e um estado de sobrepeso pode afetar os níveis hormonais nos homens . Simultaneamente, estudos demonstraram que a obesidade está intimamente relacionada a distúrbios endócrinos, tais como anormalidades dos hormônios sexuais . A obesidade em homens tem um impacto negativo no potencial reprodutivo masculino devido a alterações nos níveis hormonais . Portanto, nós testamos os níveis séricos em cada grupo. As hormonas testosterona aumentaram no grupo tratado com ZnSO4 em comparação com os grupos normal e obesidade. Parece que o tratamento com ZnSO4 aumentou significativamente os níveis de hormônio androgênico para corresponder ao nível do grupo de controle normal. A redução do peso corporal e do nível de lipídios no sangue em ratos tratados com ZnSO4 pode reparar as células de Leydig, aumentando assim o nível de testosterona. Como consequência, um sistema reprodutivo masculino funcional pode ser regenerado, ajudando a espermatogénese e a regeneração da estrutura testicular. Evidentemente, a histologia dos testículos do grupo tratado com ZnSO4 foi melhorada com células de Sertoli e Leydig regeneradas e o esperma no lúmen restaurado. Portanto, uma proteômica comparativa em larga escala fornece uma abordagem eficaz para identificar qualquer diferença de expressão de proteínas entre os grupos tratados com ZnSO4 e obesidade. Nosso estudo identificou as diferenças nos perfis de expressão de proteínas entre o esperma normal fértil e o esperma dos grupos tratados com ZnSO4.

Análise de anotação deGO mostrou que as proteínas de 24% estavam associadas ao processo metabólico e 22% das proteínas foram classificadas como proteínas com atividade catalítica. As outras proteínas foram classificadas como ligação protéica, ligação rRNA e ligação enzimática, incluindo ligação ATP. É bem conhecido que as proteínas de ligação ATP desempenham um papel fundamental nos processos biológicos, o que indica alterações nos processos sintéticos e metabólicos. As mitocôndrias são organelas que fornecem energia (ATP) às células. As mitocôndrias são também o principal alvo do stress oxidativo. No corpo masculino, as mitocôndrias são a principal planta energética no processo de maturação das células espermatogênicas e também fornecem energia para os espermatozóides após a ejaculação. Portanto, quando o stress oxidativo ocorre em homens obesos, as mitocôndrias nos espermatozóides podem ser muito danificadas. Os espermatozóides são susceptíveis ao stress oxidativo e carecem da capacidade de reparar os danos. A dieta rica em gordura induz stress oxidativo em ratos obesos, o que induz danos na membrana mitocondrial do esperma e afecta a função mitocondrial. Egwurugwu et al. concluíram que o sulfato de zinco teve alguns efeitos positivos significativos na qualidade do androgênio e do esperma em doses fisiológicas. Entretanto, foi prejudicial em doses maiores.

ARG2 é conhecido por se localizar em mitocôndrias . Também desempenha um papel crucial na produção de ornitina, que é um precursor da prolina, hidroxiprolina e poliamina, e é essencial para a proliferação celular. A obesidade e suas doenças associadas são caracterizadas por baixos níveis de inflamação crônica . ARG2 promove respostas pró-inflamatórias em macrófagos e contribui para a evidência de aterosclerose e resistência à insulina relacionada à obesidade . Acreditamos que a obesidade precoce pode levar à upregulação da arginase, resultando em mudanças sistêmicas nos metabólitos arginase e arginina. A upregulação da ARG2 no grupo dos obesos pode estar associada à proliferação celular e à inflamação crônica causada pela obesidade. A arginase melhora os lipídios hepáticos induzidos pela obesidade e as anormalidades sistêmicas de gordura, inibindo a ativação das vias envolvidas no metabolismo dos triglicérides hepáticos e na função mitocondrial .

Destas proteínas, a COX5B é particularmente interessante e está ligada à função mitocondrial e à produção de energia celular . A citocondrial oxidase (COX, Complexo IV) é uma enzima da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial que reside na membrana interna mitocondrial, e sua atividade é necessária para gerar a força motriz do próton que impulsiona a síntese de ATP a jusante. É uma das três isoformas mitocondriais da citocondrial oxidase, ou seja, o Complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial. A COX5B está envolvida na etapa final da fosforilação oxidativa, com a produção de H2O, e a manutenção do gradiente eletroquímico necessário para a produção de ATP. Assim, níveis reduzidos de ARG2 e COX5B em ratos tratados com sulfato de zinco podem sugerir um efeito induzido pelo zinco na fertilidade em ratos obesos, especialmente na regeneração testicular, espermatogênese e motilidade espermática.

Algumas proteínas expressas diferentemente identificadas neste estudo estão envolvidas no processo de transporte do zinco. Por exemplo, Elgazar et al. descobriram que o ZnT1 está presente na membrana plasmática e no citoplasma das células de suporte. Estudos demonstraram que o Znt1 tem um papel importante na homeostase de zinco em ratos adultos. O fator de transcrição-1 metal-responsivo (MTF-1) desempenha um papel na coordenação das respostas celulares à homeostase do metal e ao estresse oxidativo. O MTF-1 é um fator de transcrição dependente do zinco que estimula os genes da metalotionina e do zinco transportador-1 (ZNT-1) com concentração crescente de zinco . Foster et al. mostraram que a expressão relativa do mRNA do transportador de zinco foi muito variável. O ZnT1 é o mais abundante nos testículos, e tem interações no transporte de zinco através da membrana plasmática. Noh et al. relataram que os níveis de mRNA de ZnT1 foram levemente elevados em mulheres obesas, e alterações no transportador de zinco também podem estar associadas com estados inflamatórios relacionados à obesidade.

O homólogo de anticorpos Ly1 reativo (LYAR) foi primeiramente descrito por Su et al. como um cDNA codificando a proteína do dedo de zinco isolada da linha de leucemia de células T do rato. O gene Lyar, que é conhecido por ser expresso abundantemente no testículo, codifica uma proteína nucleolar que contém um motivo de dedo de zinco C2HC tipo LYAR e três sinais de localização nuclear. Lee et al. descobriram que a proteína LYAR estava presente em espermatócitos e espermatideos, mas não em espermatozóides. Entretanto, detectamos a expressão LYAR no esperma, e sua expressão diminuiu no esperma de ratos obesos e aumentou nos grupos tratados com ZnSO4. O LYAR é identificado para ser associado com ribossomos citoplasmáticos em células germinativas e cancerígenas masculinas e está envolvido no processamento do RNA preribossômico dentro do núcleo. O LYAR é um modulador de uma das duas etapas básicas do início da tradução em células germinativas masculinas de mamíferos e em certos tipos de tumores . LYAR suprime consideravelmente a transcrição de genes de stress oxidativo, incluindo SLC7A11, HMOX1, e CHAC1. A mic oncoproteína uprega a expressão LYAR ativando sua transcrição gênica, e a upregulação do LYAR, por sua vez, protege as células cancerosas contra a apoptose oxidativa mediada pelo estresse através da redução da expressão do gene CHAC1 .

Proteína transmembrana 165 (TM165) é uma proteína transmembrana de Golgi , e sua deficiência causa uma desordem congênita de glicosilação. A TM165 é superexpressa tanto transcrição como translação no carcinoma hepatocelular e associada à capacidade invasiva do carcinoma hepatocelular. Contudo, os dados obtidos em estudos recentes dão várias indicações de sua implicação na homeostase de cálcio e manganês. TM165 fornece Ca2+ e Mn2+ ao complexo Golgi em troca de H+ para sustentar as funções da lactose sintase e, potencialmente, de outras glicosiltransferases . A proteína humana Golgi TM165 pode transportar cálcio e manganês em células de levedura e bactérias . Nosso estudo descobriu que a expressão da TM165 em ratos obesos diminuiu e aumentou após a suplementação de zinco, sugerindo que a TM165 aumentou após a suplementação de zinco.

5. Conclusões

Em conclusão, os resultados deste estudo fornecem evidências de que o ZnSO4 pode melhorar os níveis hormonais, a regeneração testicular, e a fertilidade. A análise proteômica mostra ainda que ZnSO4 pode melhorar a fertilidade de ratos machos obesos, regulando a expressão de proteínas relacionadas ao metabolismo, inflamação, maturação do esperma e outras interações.

Dados disponíveis

Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão disponíveis mediante solicitação.

Divulgação

A agência financiadora não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesse em relação à publicação deste trabalho.

Acreditações

Este estudo foi apoiado pelo Projeto de Treinamento de Excelentes Talentos e Pesquisa Básica financiado pelo Governo Provincial de Hebei (Subvenção No. 20170183).