Abstract

Concentrações inibitórias mínimas (MICs) e concentrações fungicidas mínimas (MFCs) foram determinadas para 38 óleos de origem vegetal contra Candida albicans. Quatro cepas, incluindo uma cepa padrão, foram utilizadas neste estudo. Os agentes antifúngicos, Fluconazol e Anfotericina B foram usados como controles positivos. A cepa padrão (ATCC10231) utilizada neste estudo foi considerada altamente resistente ao Fluconazol: 3000 μg ml-1 de Fluconazol foi necessário para inibir parcialmente o crescimento desta estirpe, e a inibição completa não pôde ser alcançada. Outras cepas de Candida foram sensíveis a 5 μg ml-1 de Fluconazol. Todas as cepas utilizadas foram sensíveis à anfotericina B. Dos 38 óleos testados, 23 foram considerados eficazes e quinze foram ineficazes. Com base em seus MFCs, os óleos efetivos foram categorizados em três categorias. Sete óleos, que exerciam efeito fungicida com menos de 0,15% de concentração de óleos, foram agrupados na classe mais eficaz. Os óleos com MFCs na faixa de 0,16-1,5% de concentração foram considerados moderadamente eficazes. Nove óleos, que exigiam mais de 1,5% de concentração, foram considerados menos efetivos. A cepa resistente ao Fluconazol (MTCC 227) era sensível a pelo menos 23 dos óleos vegetais. Os resultados deste estudo indicam que óleos de origem vegetal podem ser utilizados como potenciais agentes anti-candida.

1 Introdução

Anfotericn B e Fluconazol são dois importantes agentes utilizados em quimioterapia antifúngica contra fungos patogénicos humanos. A anfotericina B é utilizada como droga de eleição em doentes terminais . O fármaco azole, Fluconazol, é amplamente prescrito contra várias infecções por Candida albicans . Embora muito aclamado pela sua eficácia, estes medicamentos são conhecidos por terem efeitos secundários . O Fluconazol é de natureza fungistática e há relatos de aparecimento de resistência ao Fluconazol entre os isolados clínicos de C. albicans. Assim, há necessidade de agentes antifúngicos melhores e inovadores contra infecções causadas por C. albicans que são eficazes e têm menos efeitos colaterais.

Muitos agentes naturais como produtos vegetais, incluindo extratos, óleos, etc. são tradicionalmente usados contra várias doenças . Alguns dos produtos vegetais são eficazes contra as infecções fúngicas e bacterianas . Óleos essenciais como óleo de árvore de chá, óleo de erva-limão, óleo de citronela, óleo de Palmarosha e alguns dos seus constituintes foram testados contra o crescimento in vitro de C. albicans.

Testamos a eficácia in vitro de 38 óleos vegetais contra quatro isolados de C. albicans. As concentrações inibitórias mínimas (MIC) e as concentrações fungicidas mínimas (MFC) dos óleos eficazes são relatadas. Com base em sua eficácia (MFC), os óleos são classificados em três categorias.

2 Materiais e métodos

2,1 Produtos químicos e cepas

Uma cepa padrão, cepa tipo ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), uma cepa de referência sugerida para o ensaio de Anfotericina B, e três isolados clínicos de C. albicans foram utilizados neste estudo. Os três isolados clínicos de C. albicans, ou seja, SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), foram obtidos do SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). Índia. A cepa padrão foi adquirida do Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, Índia.

Trinta e oito óleos vegetais foram usados neste estudo. Alguns dos óleos foram gentilmente fornecidos pelo Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, Índia, e os óleos restantes e os antifúngicos, Amphotericin B e Fluconazole foram comprados no mercado local.

2.2 Preparação de Inocula

Todas as cepas de C. albicans usadas neste estudo foram cultivadas a 30 °C por 24 h em uma incubadora agitadora usando o meio Peptona de Extração de Levedura e Sabouraud Dextrose. As células foram colhidas por centrifugação, suspensas em água destilada estéril e utilizadas imediatamente. O número de células foi determinado usando um hemocitômetro e ajustado para 5 × 106 cfu ml-1.

2.3 Screening of plant oils for anti-Candida activity by disc diffusion assay

The anti-Candida activity of 38 plant oils was test by standard disc diffusion assay . As placas de Agar Sabouraud Dextrose foram preparadas e semeadas com 5 × 106 ufc ml-1 usando o inóculo de cepas de Candida preparado como acima. Assépticamente, 5 μl de óleos de plantas foram manchados em discos de 5 mm de papel filtro (Whatman No. 1). Estes discos foram então transferidos para o centro das placas semeadas. Três placas foram utilizadas para cada concentração e incubadas a 30 ± 2 °C. O diâmetro da zona de inibição foi medido após 48-h de incubação.

2,4 Determinação da concentração inibitória mínima (MIC) de óleos vegetais pelo método de diluição em ágar

Concentrações inibitórias mínimas (MICs) de óleos vegetais foram determinadas pelo ensaio de diluição em ágar (23) As placas de ágar foram preparadas adicionando ágar YPD contendo várias concentrações de óleos vegetais (ou seja, 0,03-3% v/v). Entre 20 0,5% (v/v) foi adicionado para aumentar a solubilidade do óleo. Estas placas foram inoculadas com 103 ufc, usando o inóculo de cepas de Candida preparado como acima. As placas foram mantidas em triplicatas para cada concentração. Placas com Tween 20 mas sem qualquer óleo vegetal foram usadas como controle. Todas estas placas foram incubadas a 30 ± 2 °C. As placas foram observadas e o número de colónias foi contado após 48 h de incubação. Os valores de MIC foram determinados como a menor concentração de óleo que impede o crescimento visível das cepas de Candida .

2,5 Determinação da concentração fungicida mínima (MFC) de óleos vegetais usando o método de macro diluição de caldo

A concentração fungicida mínima (MFC) de óleos vegetais foi determinada pelo ensaio de macro diluição de caldo (NCCLS M27-A, método de referência recomendado para o teste de susceptibilidade antifúngica de leveduras) . Uma gama de concentrações (0,03-3% v/v) de óleo vegetal foi preparada em meio de caldo de YPD em frascos. Foi incluído Tween 80 a uma concentração final de 0,001% (v/v) para aumentar a solubilidade do óleo. Cada frasco foi inoculado com 5 × 105 cfu ml-1 das cepas de Candida. Foram utilizados como controlo frascos contendo Tween 20 mas sem qualquer óleo vegetal. Os frascos foram incubados a 30 ± 2 °C, em uma incubadora orbital agitada (100 rpm) por 48 h. De cada frasco 5 μl de cultura foi inoculado em placas YPD e incubado a 30 ± 2 °C por 48 h. As placas foram observadas e os MFCs foram determinados como a menor concentração do óleo vegetal inibindo completamente o crescimento das cepas de Candida.

3 Resultados

3.1 Triagem dos óleos vegetais para atividade anti-Candida

Os isolados de C. albicans testados mostraram sensibilidade diferente para os óleos. No entanto, a maioria dos óleos foi considerada eficaz e mostrou uma actividade considerável em concentrações muito baixas. Vinte e cinco entre os 38 óleos testados causaram uma zona de inibição de 1-30 mm (ZOI). Dezessete óleos causaram uma ZOI de 10-20 mm. Seis óleos mostraram uma ZOI de 1-9 mm contra todas as quatro cepas testadas. Os óleos de jasmim e lavanda não inibiram o crescimento das cepas de Candida, exceto CA IV. (Tabela 1). (13 óleos não conseguiram inibir o crescimento das cepas de C. albicans em doses de 5-μl.)

3.2 Determinação do MIC de óleos vegetais contra C. albicans

MICs dos 23 óleos efetivos e dois medicamentos amplamente prescritos, Fluconazole e Anfotericina B, foram determinados contra os quatro isolados de C. albicans. Os óleos exibiram inibição do crescimento dependente da concentração. Em alguns casos, as cepas testadas mostraram sensibilidade diferente, mas não houve diferença considerável na MIC (Tabela 2).

Todos os quatro isolados foram encontrados sensíveis à anfotericina B. A 2.5 μg ml-1 concentração de anfotericina B foi suficiente para inibir completamente o crescimento da estirpe CAI e da estirpe CA IV (ATCC10231). A estirpe CA II e CA III requereu 3 μg ml-1 Anfotericina B para inibição total do crescimento (Tabela 2).

A resposta ao Fluconazol foi encontrada como divergente. A tensão Ca III foi a mais sensível e apenas 2 μg ml-1 de Fluconazol foi suficiente para inibição total do crescimento. As cepas CA I e CA II necessitaram de 5 μg ml-1 de Fluconazol () para completa inibição do crescimento (Tabela 2). A deformação CA IV foi altamente resistente ao Fluconazol: 3000 μg ml-1, ou seja, 1500 vezes a MIC da estirpe CA III, foi necessário para uma inibição parcial do crescimento. A inibição completa do crescimento não pôde ser alcançada nesta linhagem mesmo com uma concentração muito alta.

A 0,01% de concentração de óleo de canela foi suficiente para inibir completamente o crescimento de todos os quatro isolados. Os óleos de Jasmim e Lavanda causaram apenas uma ligeira inibição do crescimento e não conseguiram inibir completamente o crescimento. Sete óleos inibiram completamente o crescimento das cepas de C. albicans, na faixa de concentração de 0,03-0,15%. Para 11 óleos MIC variou de 0,16% a 1,0%. Cinco óleos exigiram uma concentração superior a 1,0% (Tabelas 2 e 3).

3.3 Determinação de MFC de óleos vegetais contra C. albicans

Concentração fungicida mínima (MFC) é definida como a menor concentração de óleo resultando na morte de 99,9% do inóculo. Todos os óleos que inibem o crescimento mostraram atividade fungicida exceto os óleos de Jasmim e Alfazema. Em geral, observou-se que a concentração fungicida era maior que a MIC, exceto em alguns casos como os óleos de hortelã-pimenta, gerânio, ócimo, cravo e erva-dendê, que causaram a morte de 99,9% do inóculo na MIC. De acordo com seu MFC contra ATCC10231, os óleos efetivos poderiam ser classificados em três classes. Os óleos que causaram efeito fungicida a 0,03-0,15% de concentração são considerados como os mais eficazes (EM). Os óleos que requerem concentração de 0,15-1,0% são incluídos no grupo moderadamente eficaz (MoE). Aqueles encontrados com concentração superior a 1,0% são considerados como menos eficazes (LE).

Os óleos que causaram efeito fungicida a mais de 1,0% são considerados como menos eficazes (EM) (Tabelas 2 e 3). O óleo de canela foi o melhor, tendo efeito fungicida a 0,03% de concentração nos quatro isolados de C. albicans. O óleo de cravo foi fungicida a 0,12% de concentração e não houve diferença entre o MIC e o MFC. Na maioria dos óleos de ME, foi necessário 2-4 vezes MIC para o efeito fungicida. A resposta dos isolados de Candida a alguns membros deste grupo foi divergente, ou seja, da estirpe CA II no caso do óleo de hortelã japonês e óleo de Gengibre, CA III no caso do óleo de Capim Limão e CA IV no caso do óleo de Gengibre (Tabela 2).

O óleo de hortelã-pimenta e óleo de árvore de chá foram os melhores entre o grupo de sete membros do MoE, causando efeito fungicida a 0,25% de concentração (Tabela 3). O óleo de Tulsi foi fungicida a 0,5% de concentração, 1% foi o MFC dos óleos de cânfora, limão, ócimum e ylang-ylang. Também foi encontrada uma diferença de sensibilidade para alguns membros deste grupo. Para estes óleos foi necessário duas vezes o MIC, exceto para os óleos de hortelã-pimenta e de Ocimum (Tabela 2).

Nine oils were found to be less effective (Tabela 3). Estes óleos exigiram mais de 1,0% para exercer o efeito fungicida. O MFC destes óleos variava de 1,0% a 3% exceto no caso dos óleos de Jasmim, Gengibre e Zimbro, que não eram fungicidas até a concentração de 3%. CA II e CA III mostraram sensibilidade diferente (Tabelas 2 e 3).

4 Discussão

Atividade anti-candida de alguns dos óleos essenciais como o óleo de árvore de chá é bem conhecida . Muitas das preparações usadas contra a candidíase vaginal causada por C. albicans contêm óleo de árvore de chá como um componente ativo . Vários óleos de origem vegetal têm sido sugeridos em medicamentos alternativos contra infecções microbianas, incluindo candidíase e gengivite . No entanto, os agentes antifúngicos azole e seus derivados continuam a dominar como medicamentos de eleição contra as infecções por Candida, como aplicações tópicas ou como medicamentos orais . Com exceção do óleo de árvore de chá, que tem uma história de mais de 80 anos de uso na Austrália, não muitos produtos herbais entraram no mercado. Alguns produtos que contêm óleo de alecrim são utilizados contra fungos causadores de caspa . Foi relatada actividade in vitro anti-candida de óleos essenciais como Tea tree, Lemongrass, Citronella, Peppermint e Palmarosa . Examinámos a eficácia de 38 óleos de origem vegetal para a actividade anticandiária in vitro contra quatro isolados de C. albicans (Tabelas 1 e 2). Pelo menos 23 dos óleos testados mostraram ser promissores como agentes eficazes. Estes óleos poderiam ser classificados de acordo com a sua eficácia (Tabela 3). Um dos isolados que se verificou ser resistente ao Fluconazol foi inibido em concentrações muito baixas de todos os óleos de origem vegetal eficazes testados neste estudo (Tabela 2).

O ensaio de difusão em disco é um método padrão amplamente utilizado para o rastreio rápido de produtos naturais para a actividade antifúngica. Nós crivamos óleos vegetais usando este método de ensaio muito conveniente. Este estudo indica que é necessário ter cuidado, já que diferentes óleos podem ter diferentes taxas de difusão em placas de ágar e isto pode contribuir para a variação das zonas inibitórias, levando a conclusões errôneas quanto à sua atividade antifúngica. Por exemplo, alguns dos óleos que exibiram zonas de inibição menores em comparação com outros foram muito eficazes contra as cepas de Candida no ensaio de diluição do caldo NCCLS que não envolve difusão. Por exemplo, o óleo de canela exibiu um ZOI de 24 mm no ensaio de difusão em disco, onde o óleo de erva-limão mostrou 30 mm. Mas no ensaio de MFC o óleo de Canela (0,01%) foi encontrado melhor que o óleo de Capim Limão (0,06%). A atividade fungicida é considerada como uma qualidade desejável para agentes antifúngicos, uma vez que poderia eliminar totalmente o fungo dos tecidos. A anfotericina B é fungicida, é conhecida por ser muito eficaz contra fungos patogênicos humanos e é usada como droga de escolha em infecções fúngicas sistêmicas, apesar de seus graves efeitos colaterais. Fluconazol, o agente antifúngico amplamente prescrito contra infecções por Candida, é fungicida por natureza e pode requerer uso prolongado .

É encorajador notar que a maioria dos óleos usados neste estudo foram fungicidas em baixas concentrações. Não há muita informação disponível sobre o modo de acção dos produtos naturais que inibem o crescimento da Candida. Mais cepas de Fluconazol/azol resistente precisam ser incluídas em estudos futuros. Os óleos vegetais podem ser usados como agentes anti-candida contra estirpes resistentes a azole. A maioria dos óleos usados neste estudo tem um longo histórico de utilização em alimentos, confeitaria e como componentes de perfume. No entanto, se eles devem ser considerados em preparações tópicas, uma exploração cuidadosa de seus prováveis efeitos irritantes e outros efeitos indesejáveis em humanos precisa ser feita.

Acknowledgements

Authors are grateful to Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) India, for encouragement.

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