Discussão
No presente estudo, demonstramos que a RM e a GR estão presentes no córtex adrenal do rato. Mostramos que a alteração da atividade de MR regula a produção de aldosterona na ZG de uma forma que se encaixa num mecanismo de feedback negativo. Este efeito é específico para a RM, já que a modulação da atividade da GR na ZG não teve efeito sobre a produção de aldosterona. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a expressão do MR e seu papel na regulação da secreção de aldosterona dentro do córtex adrenal. No ZF/ZR, observamos um ciclo de feedback semelhante quando modificamos farmacologicamente a atividade do GR. Curiosamente, a ativação da RM também suprimiu a secreção de corticosterona nas células ZF/ZR. Nossos achados estão de acordo com estudos anteriores mostrando que a síntese do glicocorticóide adrenal pode ser modulada por esteróides sintetizados dentro do córtex adrenal (Baird et al. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).
Ativação RM com FLUDRO exerceu um efeito negativo na produção de aldosterona em células ZG preparadas a partir de ratos mantidos em dietas HS e LS, enquanto que o ácido canrenoico, um antagonista de RM, regulou positivamente a esteroidogênese com aumento da secreção de aldosterona em células ZG de ratos alimentados com LS. Vimos uma resposta mais pronunciada nos grupos LS em comparação com os grupos HS. A falta de efeito de um agonista e antagonista de GR na liberação de aldosterona basal e estimulada das células ZG é altamente indicativo de que o laço de feedback regulatório é específico do receptor.
Qual poderia ser a relevância fisiológica e clínica de um laço de feedback ultra-curto de aldosterona? Existe uma relação estreita entre a produção de aldosterona e fatores ambientais, por exemplo, ingestão de sódio e potássio, postura, hora do dia e perda de volume. Há muito tempo foi estabelecido que níveis inadequados de aldosterona, para o nível desses fatores ambientais, levam a uma variedade de doenças cardiovasculares e metabólicas em humanos e outros animais. Portanto, loops de feedback negativo criticamente sensíveis são importantes para a manutenção de uma homeostase normal. Isto é particularmente relevante para a homeostase de volume/sódio, pois mesmo um pequeno desalinhamento das respostas às mudanças no consumo ambiental de sódio ao longo do tempo pode levar a efeitos cardiovasculares adversos substanciais. Estas consequências potenciais são provavelmente o motivo pelo qual existem vários controlos e equilíbrios nos sistemas que regulam o volume/ homeostase de sódio, por exemplo, sistema renina-angiotensina, aldosterona, peptídeos natriuréticos, endotelina, vasopressina e o rim (fluxo sanguíneo renal, túbulo proximal, laço de Henle e túbulo distal/caminho colector). Estes factores reguladores são controlados, em parte, por: (1) laços de retroalimentação negativa “longos”, por exemplo, laços de retroalimentação negativa volume-renina-angiotensina-aldosterona; (2) direção de ação de fatores de ação contrários, por exemplo, peptídeos natriuréticos suprimindo a secreção de aldosterona e (3) laços de retroalimentação ultra-curtos, por exemplo, supressão direta da liberação de renina do aparelho justa-globular pela interação da angiotensina II com o receptor de angiotensina tipo 1. Em alguns aspectos, as funções dos loops de realimentação ultra-curtos são análogas ao conceito quase universal de inibição do produto da função enzimática. Paralelamente ao efeito da angiotensina II, o estudo atual suporta a hipótese de que existe também um loop de retroalimentação ultra-curto que modifica a produção de aldosterona em seu ponto de síntese final usando o nível de aldosterona e o MR. Esta etapa refina ainda mais a produção de aldosterona para garantir que ela seja apropriada para o ambiente no qual o organismo atualmente reside. Naturalmente, também fornece outro ponto nestes mecanismos homeostáticos de volume onde a disfunção pode levar à disfunção cardiovascular e à doença. Dois relatórios são potencialmente relevantes para estas possibilidades. Em contraste com os estudos atuais em células ZG normais onde o RU 486 não teve efeito na secreção de aldosterona, em duas condições alteradas, células tumorais primárias de aldosterona (Burton et al. 2011) e ratos obesos Zucker hipertensivos (Clapham & Turner 1997), o RU 486 suprimiu os níveis de aldosterona plasmática mas não os níveis de corticosterona plasmática. Similar ao presente estudo, o RU 486 não alterou os níveis de aldosterona nos ratos controle (Clapham & Turner 1997). De interesse, nas células tumorais, os antagonistas de MR não tiveram efeito sobre a produção de aldosterona. A ativação da RM não foi realizada. Como níveis similares de aldosterona e cortisol foram encontrados nas preparações celulares, a mistura celular estava presente ou um tipo celular alterado estava presente (Burton et al. 2011). Finalmente, os resultados do presente estudo podem ser aplicáveis à regulação de esteróides fora da adrenalina com sua provável relevância fisiológica e clínica.
Como as alterações na atividade da RM modificam a secreção de aldosterona? O aumento da secreção de corticosterona com supressão concomitante na produção de aldosterona sugere que a via tardia da biossíntese da aldosterona é o local de regulação. O último passo na síntese da aldosterona baseia-se na actividade do CYP11B2 (aldosterone synthase) (Mornet et al. 1989). A diminuição na conversão da corticosterona em aldosterona deve-se muito provavelmente à diminuição da actividade do CYP11B2 e não a uma mudança na expressão do CYP11B2 devido à curta (1 h) duração das nossas experiências. O nosso achado de diminuição dos níveis proteicos de CYP11B2 sob condições HS e o mecanismo proposto de modificação da actividade de CYP11B2 por MR é provavelmente responsável pela atenuação do ciclo de feedback regulamentar numa dieta rica em sal.
A baixa ingestão de sódio é um estimulante bem conhecido da secreção de aldosterona (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), e os nossos resultados estão de acordo com estes relatórios. Observamos uma elevação da corticosterona no soro com uma dieta rica em sal. Consistente com um aumento da corticosterona sérica, células isoladas de ZF/ZR de ratos com uma dieta rica em sal mostraram uma maior secreção basal de corticosterona. Os mecanismos pelos quais a dieta com sódio afeta a secreção de corticosterona não foram investigados, embora estudos anteriores tenham mostrado que as adrenais de ratos deficientes em sódio reduziram a secreção de corticosterona (Eisenstein & Strack 1961). A corticosterona pode ser produzida tanto pela ZF/ZR como pela ZG, embora a maior parte da corticosterona circulante seja proveniente da ZF/ZR devido à sua massa substancialmente maior. No entanto, como a liberação de corticosterona basal das células ZG não foi afetada por mudanças na ingestão de sódio na dieta, deduzimos que as células ZF/ZR contribuíram para o aumento da corticosterona sérica com alta ingestão de sódio.
A existência de um laço de feedback intra-adrenal exercido por glicocorticóides e GR para regular a produção de glicocorticóides tem sido sugerida há muito tempo por vários estudos in vivo (Peron et al. 1960, Hill & Singer 1968) e in vitro (Morrow et al. 1967, Carsia & Malamed 1983). Estes estudos relatam resultados contrastantes quanto a se os glicocorticóides inibem ou estimulam a produção de glicocorticóides. A direção da regulação parece depender do modelo experimental utilizado e da duração do tratamento. Neste estudo, fornecemos evidências de um feedback regulatório negativo sobre a secreção de corticosterona consistente com os achados de Carsia & Malamed (1983), embora outros investigadores tenham relatado achados opostos (Darbeida & Durand 1987, Li et al. 2011, Asser et al. 2014). Apesar do grande corpo de trabalho, os mecanismos pelos quais os glicocorticóides regulam a esteroidogênese não são bem compreendidos. Nossos resultados mostrando uma depressão acentuada na secreção de corticosterona somente nas células ZF/ZR estimuladas por ACTH com tratamento DEX estão de acordo com os achados de Latner e colegas de trabalho (Latner et al. 1977), que sugerem que os glicocorticoides diminuem a ligação do ACTH ao seu receptor. Além disso, o antagonista do glicocorticoide, RU 486, não afetou a secreção basal de corticosterona, mas estimulou a produção de corticosterona pelo ACTH. Estes dados apontam para a possibilidade da actividade da GR modificar a sensibilidade das células ZF/ZR ao ACTH. Outros trabalhos utilizando tempos de incubação mais longos sugerem que os glicocorticóides inibem a síntese protéica e regulam a transcrição em vários genes alvo no córtex adrenal (Morrow et al. 1967, Asser et al. 2014). Embora esta explicação pareça improvável em nosso estudo devido à duração de nossos experimentos, não podemos excluir a possibilidade de que efeitos genômicos possam ter contribuído para nossas observações.
Uma descoberta surpreendente em nosso estudo foi que o ZF/ZR em contraste com o ZG não demonstra especificidade de receptor. A ativação do GR ou do MR pode suprimir a produção de corticosterona na ZF/ZR. A ativação do MR foi relatada para modular a produção de glicocorticóides, mas este efeito é demonstrado apenas no cérebro. A administração de fludrocortisona em humanos foi encontrada para inibir as concentrações de cortisol pela desregulação do eixo hipotalâmico-hipófise (HPA) (Otte et al. 2003, Buckley et al. 2007, Lembke et al. 2013). A clara influência da RM no controle de feedback do glicocorticóide HPA foi ainda demonstrada quando foi demonstrado que o ácido canrenoico tem um efeito oposto sobre o cortisol e a secreção de ACTH (Arvat et al. 2001, Wellhoener et al. 2004). Nossos achados sugerem que, além da atividade de RM regular centralmente a produção de glicocorticóides, ela também pode regulá-la localmente na adrenal, embora a regulação aparentemente dependa do nível de ingestão de sal. Em ambas as dietas em resposta ao ACTH, a ativação da RM inibe a produção de corticosterona, mas, por razões pouco claras, na dieta pobre em sal, parece aumentar os níveis de corticosterona. Dado que in vivo o fluxo sanguíneo adrenal é de ZG para ZF/ZR, a aldosterona poderia ter efeito parácrino na produção de glicocorticóides com interessantes implicações fisiológicas e fisiopatológicas.
Uma limitação do estudo foi que a contaminação entre as zonas glomerulosa e fasciculata poderia potencialmente obscurecer as mudanças em resposta a diferentes estímulos. Pensamos que isto é improvável com base na ausência de CYP11B2 nos dados ZF/ZR e microscópicos, onde as células ZF/ZR e ZG têm características distintas, mostraram pouca ou nenhuma contaminação nos dois preparativos celulares. Uma segunda limitação é que o presente estudo não pode avaliar a importância relativa destes parácrinos em relação aos efeitos endócrinos clássicos que controlam a esteroidogénese adrenal. Uma terceira limitação é que não sabemos se o cortisol ou a corticosterona ao interagir com a RM pode ter o mesmo efeito que a aldosterona. Entretanto, como mencionado anteriormente, dada a direção do fluxo sanguíneo da glomerulosa para as zonas fasciculadas, se ocorresse não seria um efeito local, parácrino. Em quarto lugar, não podemos descartar a possibilidade de reactividade cruzada entre o agonista da RM e o antagonista com GR. Embora se saiba que a fludrocortisona exerce alguma atividade glucocorticoide, sua afinidade com a RM é 15 vezes maior que a da GR (Agarwal et al. 1977). Não há relatos que saibamos a respeito da interação do ácido canrenoico com GR em qualquer dose. Quinto, quando não vimos um efeito de uma manipulação na produção de esteróides basais, não podemos concluir com certeza que não há nenhuma como uma interpretação igualmente plausível seria que nossos sistemas de ensaio não são sensíveis o suficiente para captar pequenos efeitos. Finalmente, a extrapolação destes estudos em ratos para humanos é incerta.
Em conclusão, além dos clássicos e longos loops de feedback regulando a produção de esteróides adrenais, o presente estudo suporta a hipótese de que existem loops regulatórios negativos ultra-curtos mediados especificamente por MR na secreção aldosterona e GR na produção de corticosterona em células isoladas ZG e ZF/ZR, respectivamente. Relatamos aqui a inesperada descoberta de que a ativação da RM também regula negativamente a secreção glucocorticoide nas células ZF/ZR. A forma como estes pequenos loops de feedback interagem com os seus longos loops de feedback é incerta. Entretanto, estes achados levantam questões intrigantes em relação à regulação fisiológica e potencial desregulação fisiopatológica da produção destes esteróides.