Os requisitos essenciais para os ensaios enzimáticos são descritos e são discutidos os erros e armadilhas que ocorrem frequentemente, bem como a sua prevenção. Os principais fatores que devem ser considerados para o ensaio de enzimas são temperatura, pH, força iônica e as concentrações adequadas dos componentes essenciais como substratos e enzimas. A padronização destes parâmetros seria desejável, mas a diversidade das características das diferentes enzimas impede a unificação das condições do ensaio. No entanto, muitas enzimas, especialmente as de origem mamífera, possuem um pH ótimo próximo ao pH fisiológico de 7,5, e a temperatura corporal de cerca de 37 °C pode servir como temperatura de ensaio, embora, por razões experimentais, frequentemente seja preferível 25 °C. Mas em muitos casos as características particulares de cada enzima ditam condições de ensaio especiais, que podem desviar-se consideravelmente das condições recomendadas.

Além disso, valores exatos para as concentrações dos componentes do ensaio, tais como substratos e enzimas, não podem ser dados, a menos que regras gerais, dependendo do grau relativo de saturação, possam ser declaradas. Regras para a realização do ensaio enzimático, manuseio apropriado, aspectos metódicos, preparação de misturas de ensaio e blanks, escolha do tempo de ensaio, são discutidos e sugestões para evitar erros freqüentes e triviais são dadas. Particularidades de ensaios enzimáticos mais complexos, incluindo reacções reversíveis e testes acoplados são considerados.

Finalmente o tratamento dos dados experimentais para estimar a actividade enzimática é descrito. O procedimento para determinar a velocidade inicial da enzima e sua transformação em unidades enzimáticas definidas, bem como sugestões para documentação dos resultados são apresentados.

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