Abstract
Examinamos os efeitos do tratamento com sulfato de vanádio (VOSO4) a 5 e 10 mg/kg durante 30 dias na atividade endócrina do pâncreas e histologia em ratos não diabéticos e diabéticos induzidos por STZ. No grupo diabético, os níveis de glicose no sangue aumentaram significativamente enquanto o nível de insulinemia diminuiu acentuadamente. No final do tratamento, VOSO4 na dose de 10 mg/Kg normalizou o nível de glicose no sangue no grupo diabético, restabeleceu a insulinemia e melhorou significativamente a sensibilidade insulínica. O VOSO4 também aumentou de forma dose-dependente o número de células beta imunopositivas de insulina em ilhotas pancreáticas de ratos não-diabéticos. Além disso, no grupo STZ-diabético, a diminuição do número de células beta imunopositivas de insulina foi corrigida para atingir o nível de controle principalmente com a dose mais alta de vanádio. Portanto, o tratamento VOSO4 normalizou os níveis plasmáticos de glicose e insulina e melhorou a sensibilidade insulínica na diabetes STZ-experimental e induziu a proliferação e/ou regeneração de células beta em ratos normais ou diabéticos.
1. Introdução
Vanádio é um metal de transição. Estima-se que mais de 60 mil toneladas deste elemento são emitidas para a atmosfera a cada ano como resultado de atividades humanas, principalmente a partir da combustão de combustíveis fósseis.
Após a entrada no sistema circulatório através do trato gastrointestinal ou respiratório, os compostos de vanádio são transportados por transferrina ou, menos comumente, por albumina ou por componentes plasmáticos de baixa molecular, como os citratos e, em menor extensão, lactatos ou fosfatos. Muitos estudos foram realizados com derivados inorgânicos e orgânicos de vanádio em modelos animais induzidos por diabetes, nos quais os compostos estudados tiveram impacto nos níveis de glicose, colesterol e triglicérides, sem efeitos colaterais prejudiciais significativos sobre a administração prolongada. Muitas experiências também foram realizadas em pacientes diabéticos, confirmando o efeito terapêutico dos compostos de vanádio nos níveis de glicose no sangue com poucos efeitos tóxicos .
Vanádio (incluindo vanadil e vanadate) demonstrou reduzir o nível de glicose no sangue estimulando a glicogênese, a absorção e o metabolismo da glicose e inibindo a formação de glicose via gluconeogênese hepática e glicogenólise . Foi descoberto que os compostos de vanádio e vanádio exibem uma atividade semelhante à insulina, imitando as ações da insulina através da ativação da tirosina quinase do receptor de insulina e das vias em cascata de fosforilação cinase. Portanto, o sulfato de vanadil tem sido sugerido como um agente terapêutico para o tratamento da diabetes tipo 1 . O tratamento com estreptozotocina (STZ) destrói as células produtoras de beta insulina do pâncreas e os ratos diabéticos induzidos por STZ são considerados como um modelo de diabetes mellitus tipo 1 . Embora tenha sido demonstrado que os compostos de vanádio têm propriedades antidiabéticas no modelo diabético induzido por STZ, o mecanismo das suas acções permaneceu actualmente sob investigação. O objetivo deste estudo foi investigar as respostas de 30 dias de tratamento com sulfato de vanádio em ratos não diabéticos e diabéticos induzidos por STZ.
2. Materiais e Métodos
2.1. Preparação de ratos diabéticos
Os animais foram feitos diabéticos por injeção intraperitoneal (ip) de STZ em dose única de 65 mg/Kg em tampão citrato 0,01 M (pH 4,5). Este método ip foi escolhido com base em relatórios recentes que demonstraram um efeito acentuado de aumento da glicose em ratos diabéticos STZ .
2,2. Animais e Tratamento
Ratos Wistar machos, 5-6 semanas de idade (peso 175-200 g), foram adquiridos do Pasteur Institute of Tunisia e utilizados de acordo com o Comitê de Ética Local da Universidade de Tunis para o uso e cuidado de animais de acordo com as recomendações do NIH. Foram-lhes fornecidos alimentos (dieta de pellets padrão-Badr Utique-TN) e água ad libitum e alojados cinco por gaiola sob temperatura recolhida (22°C) com um ciclo luz-escuro de 12 horas. Os ratos foram divididos em seis grupos.
Grupo 1 era de animais não diabéticos de controle (controle ND) e receberam diariamente uma injeção intraperitoneal (ip) de NaCl 9. Os grupos 2 e 3 eram de NaCl e receberam diariamente uma dose de 5 ou 10 mg de VOSO4/Kg, respectivamente (ND + 5 mg/Kg e ND + 10 mg/Kg), por 30 dias. O grupo 4 foi um controle diabético (controle D) injetado com uma dose única de 65 mg/Kg de STZ. Os grupos 5 e 6 foram compostos por animais diabéticos STZ tratados com 5 ou 10 mg/Kg de VOSO4 durante 30 dias, respectivamente (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Os grupos STZ foram tratados com VOSO4 após 48 horas de diabetes induzido por STZ.
2,3. Ensaios Bioquímicos
Todos os animais foram jejuados 12 horas antes da determinação da glicemia por um glucômetro (ACCU-CHEK-Active Roche). A sensibilidade insulínica foi medida após injeção ip de 1 U/Kg de insulina e os níveis de glicemia foram determinados em intervalos de 30 minutos durante 2 horas como a porcentagem do nível hormonal em .
Animais foram sacrificados após 24 horas do último tratamento e o sangue foi coletado e o soro foi processado para estimativa de insulina que foi determinada pelo kit Elisa (distribuído pelo BioVendor).
2,4. Avaliação imunohistoquímica
A coloração imunohistoquímica da insulina foi realizada a fim de caracterizar a integridade das células beta nas ilhotas de Langerhans. Para isso, cortes de tecido mostrando a superfície máxima maior das ilhotas de Langerhans foram selecionados para comparação entre os grupos. Os cortes foram primeiramente desparafinados, hidratados através de uma série gradual decrescente de etanol, imersos em citrato de tampão (pH 6) por 40 min, e depois incubados com um anticorpo policlonal anti-insulina Guinea Pig diluído em Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 (DAKO). Após a lavagem, os cortes foram incubados com anticorpo anti-Guinea Pig conjugado à fosfatase e o procedimento de revelação foi assistido pela máquina TechMate 500. Finalmente, os cortes foram corados com hematoxilina/eosina.
Ten ilhotas pancreáticas por rato foram examinadas ao microscópio e o número de células insulino-positivas e insulino-negativas foi contado através da numeração de seus núcleos. Os dados são expressos como a percentagem de células imunopositivas de insulina/ número total de células em cada ilhota.
2,5. Análise estatística
Significado da diferença entre vários grupos foi avaliado pela análise de variância unidirecional (ANOVA) seguida pelo teste de comparação múltipla de Tukey, e o valor foi tomado como significativo no nível.
3. Resultados
O efeito do tratamento VOSO4 sobre os níveis de glicemia em ratos não diabéticos (ND) e diabéticos (D) é mostrado na Figura 1. Não houve alterações significativas nos níveis de glicemia no grupo ND de controle durante o tratamento (Figura 1(a)). O tratamento de ratos ND com VOSO4 a 5 ou 10 mg/Kg não alterou significativamente os níveis de glucose no sangue durante os primeiros 10 dias. No entanto, o nível de glicemia diminuiu significativamente no final do tratamento com a dose de 5 mg/Kg e foi significativamente reduzido de 15 para 30 dias com a dose de 10 mg/Kg, em comparação com o grupo de EC de controlo. No dia 30, a diminuição da glicemia foi de cerca de 8 e 15%, respectivamente, para as doses de 5 e 10 mg/Kg em comparação com o grupo controle. Como se suspeitava, foi observado um aumento notável do nível de glicemia nos ratos controle tratados com STZ em comparação com animais não tratados (versus mg/dL), indicando uma instalação de diabetes que foi mantida durante todo o experimento. O tratamento do grupo diabético (D) com 5 mg/Kg de VOSO4 reduziu significativamente o nível de glicemia a partir do 10º dia, enquanto uma dose de 10 mg/Kg diminuiu o nível de glicemia de forma significativa e gradual a partir do 5º dia até atingir o nível normal no 30º dia. Os valores observados de glicemia aos 30 dias foram e versus mg/dL, respectivamente, nos grupos D + 5, D + 10 e controle D (Figura 1(b)).
Tabela 1 mostrou os níveis de insulina nos grupos ND e D sem e após o tratamento com VOSO4. Os ratos ND tratados com 5 mg/Kg de VOSO4 não mostraram alterações significativas no nível de insulinemia, mas um aumento acentuado foi obtido com 10 mg/Kg em comparação ao grupo controle ND ( versus µg/L). Além disso, no grupo controle D, a insulinemia foi profundamente reduzida em comparação aos animais controle ND ( versus µg/L). A administração de VOSO4 no grupo D aumentou acentuadamente a insulinemia de forma dose-dependente. De fato, os níveis de insulina foram aumentados em ratos diabéticos de para e µg/L com, respectivamente, 5 mg e 10 mg/Kg de dose.
As alterações de sensibilidade à insulina após a injeção ip de insulina (1 U/Kg) em animais normais e tratados com diabéticos são mostradas na Figura 2. Em ratos ND, o tratamento com 10 ou 5 mg de VOSO4 não alterou o perfil glicêmico em resposta à administração de insulina (Figura 2(a)). De fato, nesses grupos, o efeito hipoglicêmico máximo da insulina foi observado em 60 e 90 min, respectivamente, e foi aproximadamente do valor inicial de glicemia. Animais diabéticos tratados com a baixa dose de VOSO4 apresentaram um perfil glicêmico semelhante ao do grupo controle D com uma diminuição máxima de 60 min, enquanto aqueles tratados com a alta dose apresentaram uma diminuição significativa () e uma diminuição máxima rápida da glicemia em 30 min após a injeção de insulina (Figura 2(b)).
Nos grupos de tratamento VOSO4, observou-se que o tamanho das ilhotas pancreáticas era maior em comparação com seus respectivos grupos controle ND e D (Figuras 3 e 4). Análises estatísticas mostraram que os tratamentos VOSO4 induziram um aumento acentuado no número de células imunopositivas de insulina em cerca de 20% nos grupos ND + 5 e 27% nos grupos ND + 10 mg/Kg (Figura 5). O tratamento VOSO4 aumentou significativamente o número de células insulino-imunopositivas nos grupos STZ-diabéticos em 12 e 23%, respectivamente, com doses de 5 e 10 mg/Kg (Figura 5). A comparação entre os grupos tratados com STZ-diabéticos e os ratos controle de ND não indicou diferenças significativas.
(a)
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Immunohistoquímica de coloração de insulina nas células beta da ilhota pancreática de Langerhans de STZ-ratos diabéticos. Note que existem mais células imunopositivas de insulina nos ratos diabéticos STZ tratados do que nos ratos diabéticos STZ não tratados. Controlo D (a), D tratado com 5 mg/Kg de VOSO4 (b), e D tratado com 10 mg/Kg de VOSO4 (c). Foram analisadas dez ilhotas por rato. Barra de escamas: 50 µm.
Efeito do sulfato de vanadil no número de células beta em %. Os valores representam média ± SD. ; versus controle ND. ; versus controle D. versus D + 5 mg/Kg. Foram analisadas 10 ilhotas por rato.
4. Discussão
Estudamos as propriedades antidiabéticas do vanádio, explorando seus efeitos sobre a glicemia e os níveis de insulina, bem como as células B do pâncreas endócrino.
Usando ratos diabéticos induzidos por STZ, mostramos que o tratamento com sulfato de vanadil (VOSO4) a 5 e 10 mg/Kg reduziu significativamente os níveis médios de glicemia no 10º e 5º dias, respectivamente, em comparação com o grupo controle sem tratamento. No 30º dia, os ratos diabéticos, dada a maior dose do composto, exibiram níveis de glicemia semelhantes aos dos animais de controle da EC. Entretanto, em ratos ND, o tratamento com a menor dose de VOSO4 não alterou significativamente o nível de glicose no sangue, enquanto a dose mais alta induziu pouco e gradualmente diminuiu até o 15º dia de tratamento e a glicemia foi reduzida em cerca de 14% no 30º dia. Nossos resultados estão de acordo com dados anteriores que demonstram que a administração oral de compostos de vanádio em animais diabéticos induzidos por STZ ou herdados geneticamente ou nutricionais melhorou significativamente a hiperglicemia. Em humanos, Soveid et al. relataram a segurança e a eficácia da terapia com sulfato de vanadil oral durante o período de 30 meses em pacientes diabéticos do tipo 1, diminuindo a necessidade de insulina e o nível de glicose no sangue.
Nosso estudo também revelou que o efeito hipoglicêmico do VOSO4 foi acompanhado por um aumento acentuado do nível de insulinemia basal no grupo diabético, de forma dose-dependente. Com a dose de 10 mg, o nível de insulinemia em ratos diabéticos foi quase normalizado. De fato, a diminuição dos níveis de glicose no sangue registrada particularmente em ratos diabéticos expostos ao composto de vanádio pode estar relacionada ao aumento concomitante das concentrações plasmáticas de insulina. Esses resultados estavam de acordo com dados anteriores sobre a eficácia dos compostos de vanádio no estado diabético amelhorante .
Outros, investigamos o efeito da administração de vanádio na sensibilidade insulínica em ratos diabéticos e não diabéticos. Nos grupos ND, mostramos um efeito hipoglicêmico máximo de insulina aos 60-90 min após a introdução do hormônio. No entanto, nos grupos D, o tratamento VOSO4 com uma dose de 10 mg aumentou a sensibilidade insulínica com uma diminuição mais rápida e pronunciada da glicemia após a injeção hormonal, enquanto a dose de 5 mg não alterou significativamente a resposta glicêmica dos ratos D. A melhor sensibilidade insulínica induzida pelo VOSO4 está em linha com numerosos estudos que indicam que o vanádio pode ser considerado como um potente mimético insulínico ou trófico de insulina em vários tecidos .
Foi demonstrado que os compostos de vanádio são caracterizados por múltiplas formas de acção resultando na diminuição do açúcar no sangue . Estudos in vivo e in vitro relataram que o sulfato de vanadil aumentou o transporte e metabolismo da glicose nos músculos esqueléticos, no fígado e nos tecidos adiposos . Graças à sua semelhança estrutural com os ânions de ortofosfato, os derivados orgânicos de vanádio inibem a fosfotirossina fosfatase protéica . Eles também inibem a atividade do PTP-1B, enzima responsável pela desfosforilação do receptor de insulina, causando resistência à insulina . Outro mecanismo de redução dos níveis de glicose no sangue por compostos de vanádio é a ativação da PKB/Akt kinase, levando ao aumento da absorção de glicose pelo transportador GLUT4 . A ativação do PKB/Akt estimula também a fosforilação do GSK3, resultando na estimulação da síntese do glicogênio . Por outro lado, verificou-se que a inibição da C-jun N-terminal kinase melhora a sensibilidade insulínica na diabetes experimental .
Vanádio aumenta o transporte e a oxidação da glicose e a atividade de tirosina-quinase do receptor de insulina e exerce efeitos semelhantes aos da insulina sobre a glicose e os metabolismos lipídicos por vias bioquímicas insulino-dependentes ou insulino-independentes .
É bem conhecido que o tratamento STZ destrói as células beta das ilhotas pancreáticas induzindo o diabetes mellitus insulino-dependente . Assim, no presente estudo, mostramos uma redução na área de ilhotas pancreáticas associada a uma diminuição acentuada no número de células beta imunoreativas para insulina no grupo diabético em comparação com animais de controle não diabéticos. No entanto, tanto nos grupos ND como D, o tratamento VOSO4 aumentou o tamanho das ilhotas pancreáticas em comparação com os respectivos grupos de controle. Mais importante ainda, o tratamento VOSO4 de ratos diabéticos aumentou de forma dose-dependente o número de células beta imunopositivas de insulina como distinguido do grupo diabético não tratado, sugerindo que o VOSO4 pode gerar as células beta em ratos diabéticos induzidos por STZ. Na verdade, o número de células beta em ilhotas de ratos diabéticos tratados com VOSO4 com 5 e 10 mg não foi significativamente diferente do do grupo ND. Isto está de acordo com investigações anteriores sobre a propriedade insulinotrópica pancreática deste composto. Curiosamente, o tratamento com vanádio também aumentou significativamente o número de células beta em ilhotas de ratos não diabéticos.
Em um modelo de camundongo do segmento aloxan-perfused do pâncreas, Waguri et al. relataram processos de regeneração de células beta a partir de células precursoras extra-isletares. De fato, em ratos STZ-diabéticos, o tratamento com VOSO4 poderia estimular a proliferação de células beta a partir de células endócrinas intra-islet e a diferenciação das células precursoras extra-islet.
Em conclusão, o presente estudo demonstra que o sulfato de vanadil poderia ser útil como um agente antidiabético em potencial. Entretanto, como as evidências atuais ainda são limitadas e baseadas principalmente em modelos animais e pouco se sabe sobre as formulações terapêuticas e os efeitos colaterais dos compostos de vanádio, são necessárias mais investigações sobre seu uso a longo prazo como terapia convencional para pacientes diabéticos.
Conflito de interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Conhecimento
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério de Ensino Superior e Pesquisa Científica da Tunísia.