Depth of Field

Consecința deschiderii numerice este că aceasta este direct legată de Depth Of Field (DOF). Pentru un obiectiv dat, privind o probă, există un anumit plan de focalizare perfectă. Adâncimea de câmp este, cât de departe deasupra și dedesubtul acelui plan se pot afla obiectivul și proba și totuși totul să fie focalizat.

Același lucru se întâmplă și în fotografia tradițională, o diafragmă foarte mică va crește adâncimea de câmp. O diafragmă numerică mai mare va da o rezoluție mai mare, dar adâncimea de câmp devine considerabil mai mică. Există o distanță deasupra planului de eșantionare și o distanță sub planul de eșantionare și, oriunde în interiorul acestora, există o focalizare practic perfectă. De îndată ce obiectivul și proba se află în afara acestei limite, imaginea începe să se estompeze.

Aceasta se numește adâncime de câmp. Formula pentru adâncimea de câmp este:

unde:
„n” este indicele de refracție al materialului dintre obiectiv și eșantion
λ (lambda) este lungimea de undă a luminii
NA este deschiderea numerică

În cele mai multe cazuri, materialul dintre obiectiv și eșantion este aerul, iar „n” este egal cu 1,00. Pentru apă, indicele de refracție al acesteia este 1,33, iar uleiul de imersie specializat pentru microscopie este 1,52. Pentru un obiectiv cu mărire mică, cum ar fi un 4X sau chiar un 10X, adâncimea tipică a câmpului este de plus sau minus 3 până la 5 microni. În acest caz, dacă eșantionul este foarte plat, este posibil ca focalizarea să nu fie necesară deloc sau să nu fie nevoie să se întâmple decât o singură dată. În general, eșantioanele variază în grosime și variază în planeitate, astfel încât este necesară focalizarea.

Pentru o mărire de 20X, care poate fi o deschidere numerică de 0,6 până la 0,8, adâncimea de câmp scade la aproximativ plus sau minus 500 de nanometri. Trecând la o mărire mare cu imersie în ulei la o deschidere numerică de 1,47, adâncimea de câmp scade foarte dramatic, Iar adâncimea de câmp ar putea fi de plus sau minus 0,1 până la 0,2 microni (100 – 200 nm). Aceasta este o toleranță foarte strânsă. La 100 de nanometri sau 200 de nanometri, modificări foarte mici ale planeității probei sau ale înălțimii probei, sau ale preciziei căilor de ghidare ale treptei de mișcare a probei XY, vor face dificilă menținerea focalizării. Pentru menținerea focalizării în această situație, un sistem de autofocalizare cu laser cu urmărire continuă conectat la o treaptă de focalizare a obiectivului cu lățime de bandă mare, cum ar fi DOF-5, este modalitatea ideală de menținere a focalizării în aceste aplicații cu deschidere numerică mare, de înaltă rezoluție.

.