Proprietăți și detectarea neurotoxinei botulinice

Clostridium botulinum produce mai multe tipuri de toxine proteice decât orice alt gen de microorganisme. Caracteristica remarcabilă a Clostridium botulinum este capacitatea sa de a sintetiza o neurotoxină de o potență extraordinară. BoNT-urile cuprind o familie de toxine similare din punct de vedere farmacologic care se leagă de sinapsele colinergice periferice și blochează exocitoza acetilcolinei la nivelul joncțiunilor neuromusculare. BoNT-urile sunt produse în alimente, în intestin și în cultură sub formă de complexe de toxine progenitoare care constau din neurotoxină botulinică asociată cu proteine netoxice. S-a demonstrat că componentele netoxice ale complexelor conferă stabilitate neurotoxinei și împiedică inactivarea de către enzimele digestive din intestin.

Diagnosticul botulismului se realizează, în general, prin evaluarea simptomelor clinice la pacienți, iar în cazul focarelor de toxiinfecție alimentară, pe baza grupării cazurilor care implică un grup de persoane care au consumat un aliment comun. În majoritatea investigațiilor privind botulismul, obiectivul principal este de a detecta prezența BoNT, deoarece sporii de C. botulinum sunt răspândiți în mediul înconjurător și contaminează multe alimente. Detectarea BoNT în sânge, în conținutul gastric și în alimente oferă confirmarea botulismului. Izolarea C. botulinum dintr-un aliment suspect, din materiile fecale ale sugarilor cu simptome de botulism sau din răni oferă dovezi în sprijinul diagnosticului de botulism. Cu toate acestea, nu oferă o confirmare în cele mai multe cazuri, deoarece sporii se găsesc în alimente și, ocazional, în fecalele adulților sănătoși.

BoNT se detectează de preferință cu ajutorul unui biotest al toxinei extrase dintr-un aliment sau dintr-o probă clinică. Extractul este injectat intraperitoneal la șoareci, iar animalele sunt observate periodic pentru semnele tipice de botulism timp de până la patru zile. În funcție de cantitatea de BoNT prezentă, simptomele botulismului se observă, în general, în decurs de 4-24 de ore. Simptomele caracteristice includ scăderea mobilității animalelor, zburlirea blănii, dificultăți de respirație, contracția mușchilor abdominali care dau morfologia de „viespe”, urmată de convulsii și moarte. Animalele care prezintă aceste semne mor, de obicei, în decurs de 24-48 de ore. Animalele care mor mai devreme de 2 ore sau după 48 de ore ar trebui să se considere că au cedat la alte substanțe decât BoNT. Moartea datorată BoNT este confirmată prin neutralizare cu antitoxine specifice serotipului.

Complicațiile sunt adesea întâlnite în biotestarea la șoareci a BoNT din specimene clinice și din anumite alimente. În special, sunt frecvente decesele cauzate de substanțe care nu interferează cu botoxul. Aceste decese nespecifice pot fi, în general, evitate prin diluarea substanței letale interferente până la un punct final în care moartea este cauzată de BoNT mai puternic. Ocazional, mai mult de un serotip de BoNT poate fi prezent într-un eșantion analizat, iar confirmarea ar necesita neutralizarea cu un amestec de antitoxine. În cazul alimentelor sau al probelor clinice, decesele non-botulinice pot apărea prin infecție sau prin prezența endotoxinelor. Agenții infecțioși pot fi eliminați prin filtrare pe membrană sau prin adăugarea de antibiotice în extractul care se analizează. Extractele care conțin endotoxine pot fi, în general, diluate până la un punct final adecvat sau endotoxinele pot fi eliminate prin adsorbție. În cazul extractelor din tulpini neproteolitice de C. botulinum (grupa II), toxicitatea este crescută prin activarea cu o protează, cum ar fi tripsina. În unele alimente, tripsina poate genera peptide toxice și, prin urmare, reacția trebuie încheiată prin adăugarea de inhibitor de tripsină din soia după 30-60 de minute.

C. botulinum viabil poate fi izolat din alimente prin îmbogățire într-un mediu de creștere adecvat, cum ar fi bulionul de carne gătită cu glucoză sau medii care conțin peptone, extract de drojdie și glucoză. C. botulinum are cerințe nutritive complexe și are nevoie de un mediu bogat pentru creștere. Pentru izolare, este adesea util să se încălzească o porțiune de aliment sau de probă clinică la 80° sau 60°C pentru a selecta sporii de C. botulinum din grupele I și, respectiv, II. Ocazional, se utilizează etanol 50% pentru a inactiva celulele vegetative din probele alimentare analizate pentru grupa II de C. botulinum. În urma îmbogățirii, prezența BoNT se testează prin biotest pe șoareci, după cum s-a descris anterior. Agarurile de izolare selectivă care conțin antibiotice, inclusiv cicloserină, sulfametoxazol și trimetoprim, au fost utilizate pentru izolarea C. botulinum din grupa I din probe clinice.

Au fost dezvoltate o varietate de metode imunologice pentru detectarea BoNT, dar majoritatea nu sunt la fel de sensibile ca biotestul pe șoarece și au, de asemenea, dezavantajul potențial de a detecta BoNT biologic inactiv. S-au făcut mai multe progrese în domeniul testelor imunoenzimatice (ELISA) pentru a atenua aceste dezavantaje și este probabil că ELISA va fi utilizată pentru a completa, dar nu pentru a înlocui biotestul pe șoarece.

.