Ecluzele canalului funcționează prin curgerea gravitațională a apei din lacurile Gatún, Alajuela și Miraflores, care sunt alimentate de Chagres și de alte râuri. Ecluzele în sine sunt de lungime, lățime și adâncime uniforme și au fost construite în perechi pentru a permite tranzitul simultan al navelor în ambele direcții. Fiecare poartă a ecluzei are două foi, cu o lățime de 65 de picioare (20 de metri) și o grosime de 6,5 picioare (2 metri), așezate pe balamale. Înălțimea porților variază între 14 și 25 de metri (46 și 82 de picioare); mișcarea lor este acționată de motoare electrice încastrate în pereții ecluzei. Acestea sunt acționate de la un turn de control, situat pe peretele care separă fiecare pereche de ecluze și de unde se controlează, de asemenea, inundarea sau golirea camerelor ecluzelor. Camerele ecluzelor au o lungime de 1.000 de picioare (300 de metri), o lățime de 110 picioare (33 de metri) și o adâncime de 40 de picioare (12 metri).

Din cauza naturii delicate a mecanismelor originale ale ecluzelor, numai ambarcațiunilor mici li se permite să treacă prin ecluze fără asistență. Ambarcațiunile mai mari sunt ghidate de locomotive electrice de remorcare, care funcționează pe șine cu roți dințate pe pereții ecluzei și au rolul de a menține navele centrate în ecluză. Înainte de a putea intra într-o ecluză, trebuie trecut un lanț de protecție, întins între pereții de acces. Dacă totul decurge în mod corespunzător, acest lanț va fi lăsat să cadă în canelura sa din partea de jos a canalului. Dacă, din întâmplare, nava se mișcă prea repede pentru siguranță, lanțul va rămâne întins, iar nava se va lovi de el. Lanțul, care este acționat de o mașinărie hidraulică amplasată în pereți, va fi apoi eliberat încet, prin eliberare automată, până când nava va fi oprită. Dacă nava se desprinde de locomotiva de remorcare și, rupând lanțul, se izbește de prima poartă, o a doua poartă aflată la 15 metri (50 de picioare) va proteja ecluza și va opri avansarea ulterioară.

Sistemele de ecluze din cadrul Proiectului celui de-al treilea set de ecluze, început în 2007, au fost inspirate de ecluza Berendrecht din Anvers, Belgia, și de bazinele de economisire a apei folosite în canalele din Germania. Aproximativ 190.000 de tone de oțel, în cea mai mare parte din Mexic, sunt înfipte în beton puternic armat pentru a construi camerele ecluzelor de pe malurile Atlanticului și Pacificului, iar noile porți ale ecluzelor măsoară până la 10 metri (33 de picioare) lățime, 30 de metri (98 de picioare) înălțime și 58 de metri (190 de picioare) lungime. Noile camere și bazine, care vor controla apa care curge din lacul Gatún, au fost proiectate pentru a minimiza turbulența fluxului de apă și deranjul pentru navele în tranzit. Bazinele au fost finalizate în iunie 2016 și includ 158 de supape constând în 20.000 de tone de material structural. Oficialii spun că aceste bazine de economisire a apei sunt cele mai mari din lume și facilitează o reutilizare a apei în proporție de 60 la sută. În timp ce ecluzele existente folosesc 52 de milioane de galoane (197 de milioane de litri) la fiecare utilizare, noile ecluze folosesc 48 de milioane de galoane (182 de milioane de litri).

.