3.53.4.3 Terapia sintetică cu fagi

Bacteriofagii, sau pur și simplu numiți fagi, au jucat un rol central în dezvoltarea biologiei moleculare, a geneticii bacteriene și în furnizarea primelor instrumente de recombinare a moleculelor de ADN, cum ar fi enzimele de restricție și ligazele. În ultimul deceniu, studiul mecanismelor de rezistență a fagilor a dus la descoperirea uneia dintre cele mai importante tehnologii generice pentru SB de la PCR încoace, și anume sistemele de nucleaze CRISPR, pe care bacteriile și arheele au evoluat ca o apărare adaptivă la ADN exogen. Recenta identificare a numeroase alte sisteme antifage necaracterizate anterior ar putea oferi și alte tehnologii revoluționare pentru aplicațiile SB.45 În acest context istoric, este potrivit, așadar, ca SB să fie aplicată acum fagilor pentru a perfecționa utilizarea lor ca agenți terapeutici.

Fagii au fost descoperiți independent de Frederik Twort și Félix D’Hérelle în prima parte a secolului XX46,47 și, la scurt timp după aceea, au fost urmăriți ca agenți antimicrobieni pentru a trata boli infecțioase precum holera și ciuma. În Europa de Est, terapia cu fagi a devenit un lucru obișnuit și mai multe centre de tratament renumite există până în prezent, de exemplu, în Georgia și Polonia. În Occident, după câteva succese inițiale sporadice, terapia cu fagi a dispărut din uz pe măsură ce antibioticele au devenit disponibile pe scară largă. Astăzi, odată cu creșterea numărului de agenți patogeni rezistenți la antimicrobiene, inițial așa-numitele tulpini ESKAPE48 , dar acum un set și mai larg de agenți patogeni49 , despre care se preconizează că vor provoca mai multe decese decât cancerul până în 2050, există un interes reînnoit pentru terapia cu fagi.

Utilizarea fagilor prezintă mai multe avantaje față de antibiotice, în primul rând potențialul de a viza tulpini specifice și, astfel, de a lăsa intactă comunitatea microbiană benefică și, de asemenea, capacitatea de a depăși rezistența prin utilizarea unor cocktailuri fagice complementare, „antrenarea” fagilor pe tulpini gazdă selectate sau pur și simplu izolarea de noi fagi împotriva unui agent patogen. În schimb, pentru ca terapia cu fagi să devină un medicament fiabil și să fie adoptată pe scară largă în Occident, există mai multe obstacole care trebuie depășite și domenii de îmbunătățire, cum ar fi: studii clinice solide cu controale adecvate, reducerea timpului de identificare a fagilor cu o gamă de gazde corespunzătoare, depășirea rezistenței la fagi și a mecanismelor de excludere a tulpinii țintă fără a fi nevoie de cocktailuri complexe, evitarea răspunsurilor imune nedorite la particulele de fagi și limitarea transducției generalizate a genelor de rezistență la antibiotice sau a factorilor de virulență bacteriană. Chiar și în cazul uciderii cu succes a unei tulpini țintă, liza rapidă a unui număr mare de bacterii și eliberarea concomitentă de endotoxine și superantigeni poate duce la un răspuns infamator puternic și la un rezultat clinic nefavorabil.

Organizarea extrem de modulară a genomurilor fagilor și asamblarea structurii fagilor sub formă de module funcționale, cum ar fi fibrele de coadă, țepușele, tuburile de coadă și capsida, face ca fagii să fie ținte ideale pentru abordările SB, într-un sens, genomurile fagilor sunt deja organizate în BioBricks. Într-un model timpuriu pentru viitorul design al fagilor sintetici, fagul filamentos Pf3 a fost modificat pentru a trata infecția cu Pseudomonas aeruginosa într-un model de șoarece.50 O genă a proteinei de export a Pf3 a fost înlocuită cu o genă care codifică endonucleaza de restricție BglII, cu raționamentul că (1) această înlocuire a genei face ca Pf3 să fie nereplicativ, introducând astfel o strategie de izolare, (2) fagul poate fi propagat în mod stabil într-o gazdă care conține gena metilazei BglII și (3) BglII ar cataliza ruperi de dublu catenă în ADN genomic al tulpinii țintă pentru ucidere. O constatare importantă a acestui studiu a fost aceea că tratamentul șoarecilor infectați cu fagul modificat Pf3R sau cu un fag litizant a dat o supraviețuire comparabilă pentru șoarecii provocați cu o doză letală minimă de 3, dar la o doză letală minimă de 5, rata de supraviețuire a fost semnificativ mai bună cu terapia cu fagul Pf3R. Analiza nivelurilor serice de citokine a indicat un răspuns inflamator redus, ceea ce indică faptul că rezultatul mai bun pentru grupul de tratament cu Pf3R se datorează uciderii eficiente a tulpinii țintă fără liză și eliberare de endotoxină.

Uciderea P. aeruginosa de către Pf3R se bazează pe gama de gazde a fagului pentru a asigura specificitatea țintirii, deoarece este de așteptat ca situsurile de restricție BglII să fie prezente în esență în toate genomurile bacteriene. O îmbunătățire este sugerată de descoperirea remarcabilă a unui bacteriofag care a obținut un sistem CRISPR/Cas, dintr-o sursă necunoscută, pentru uz propriu.51 Sistemul CRISPR/Cas codificat de fag este capabil să achiziționeze noi spațieri, iar nucleaza CAS3 a fost reorientată către un element cromozomial pe care gazda sa, Vibrio cholera, îl folosește pentru imunitatea înnăscută. În urma acestei descoperiri, sistemul CRISPR de tip II de la Streptococcus pyogenes a fost modificat în bacteriofagul M13 cu spațieri pentru a ținti secvențe pentru rezistența la antibiotice și genele de virulență din Escherichia coli, autorii denumind aceste dispozitive nucleaze ghidate de ARN (RGN).52 Demonstrând specificitatea rafinată a acestui sistem, un RGN a fost capabil să ucidă în mod discriminatoriu o tulpină care adăpostea un polimorfism de un singur nucleotid în ADN girasa care conferă rezistență la chinolone. Mai mult, într-un consorțiu artificial de trei tulpini bacteriene, aceștia au fost capabili să ucidă tulpinile selectate (ucidere de 400-20 000 de ori mai mare decât în cazul controalelor), lăsând în același timp ceilalți membri ai consorțiului intacți. Specificitatea uciderii mediată de CRISPR/Cas ar putea extinde terapia cu fagi dincolo de țintirea agenților patogeni la o modulare precisă a microbiomului uman, a cărui compoziție a fost implicată în prognosticul unor tipuri de cancer și chiar în afecțiuni neurologice, cum ar fi autismul, Parkinson și Alzheimers, prin intermediul axei intestin-encefalice.

O platformă fagică sintetică ideală ar putea fi una în care legarea la gazde este proiectată pentru a fi foarte largă, în timp ce specificitatea țintirii tulpinilor este asigurată de încărcătura CRISPR/Cas. În acest fel, fagii ar putea fi implementați cu ușurință pentru tratamente, fără a fi necesară izolarea ad-hoc a unei noi platforme pentru fiecare agent patogen. În plus, gama largă de gazde, combinată cu matricele CRISPR care vizează mai multe gene de rezistență la antibiotice sau de virulență, ar putea permite utilizarea unei terapii cu fagi prezumtive, adică înainte de identificarea agentului patogen. Strategiile de extindere a gamei de gazde includ ecrane genetice frontale pentru identificarea receptorilor fagilor și a factorilor gazdă necesari53 , extragerea de secvențe de proteine de legare a receptorilor (RBP) ale profagilor din genomurile bacteriene și repornirea fagilor sintetici care ar putea, de exemplu, să codifice biblioteci de proteine de legare a receptorilor RBP pentru HTS54,55. Mascarea receptorilor de către capsule poate fi depășită prin exprimarea enzimelor de hidroliză a exopolizaharidelor56 și a altor enzime pentru a degrada biofilmele57 , în timp ce alte mecanisme de mascare și variația de fază în exprimarea receptorilor pot fi depășite prin intermediul fagilor proiectați cu mai multe fibre de coadă care conțin diferite RBP sau RBP la ținte de suprafață celulară necanonice foarte conservate. Bacteriile dispun de numeroase sisteme antifage, principalele fiind imunitatea înnăscută a modificării de restricție și imunitatea adaptivă a CRISPR/CAS, dar, invers, și fagii au contra-evoluat multiple strategii pentru a învinge aceste sisteme, cum ar fi utilizarea de nucleotide necanonice în ADN-ul lor, având mai puține situsuri de restricție sau hipermetilându-și genomul și furnizând proteine care inhibă enzimele de restricție sau îmbunătățesc enzimele de metilare ale gazdei.

Platforma de fagi sintetici descrisă aici ar evita necesitatea unor cocktailuri de fagi pentru care aprobarea de reglementare poate fi mai complexă. Țintele rămase pentru ingineria fagilor sunt generice pentru multe produse biologice, cum ar fi stabilitatea și răspunsul sistemului imunitar. Celulele fagocitare, în special, sunt responsabile pentru eliminarea particulelor de fag din sistemul circulator. Mutanții de fagi cu circulație lungă au fost obținuți printr-o tehnică de trecere în serie58 și s-a constatat că au suferit mutații la nivelul proteinei majore a capsidei. Ulterior, o modificare a unui singur aminoacid, tot într-o proteină a capsidei, introdusă prin manipulare genetică directă, a dus la o creștere de 13 000 până la 16 000 de ori a capacității fagului de a rămâne în sistemul circulator al șoarecilor.59 Alți parametri de îmbunătățire a fagilor ca agenți terapeutici, cum ar fi producția, formularea și calea de administrare, probabil că nu intră în sfera de aplicare a activităților SB, dar lecțiile învățate din lucrările anterioare cu fagi nativi se vor aplica, de asemenea, la fagii modificați prin inginerie SB.

În ultimul deceniu, odată cu reînnoirea interesului pentru terapia cu fagi și rapoartele sporadice ale unor cazuri individuale de succes la pacienți, au existat încercări de a efectua studii clinice controlate care nu au avut ca rezultat efecte adverse semnificative, dar eficacitatea încă nu a fost demonstrată cu emfază. Va fi un următor articol interesant al poveștii terapiei cu fagi, care a început în urmă cu peste 100 de ani, să vedem cum fagii modificați prin inginerie SB intră în studii clinice.

.