Abstract
Acest studiu investighează mecanismul care stă la baza efectului de îmbunătățire a zincului asupra fertilității la șobolanii obezi folosind proteomica. Au fost studiate efectele a trei doze diferite de ZnSO4 asupra spermatogenezei și a nivelurilor hormonale. Spermatogeneza testiculară a fost observată prin colorare HE. Nivelurile serice de estrogen și testosteron au fost măsurate prin imunoanaliză cu microparticule chemiluminescente. Analiza proteomică a spermei a fost efectuată prin cromatografie lichidă-spectrometrie de masă. Baza de date DAVID a fost utilizată pentru a efectua analiza îmbogățirii GO și analiza căilor KEGG a genelor exprimate diferențiat, iar baza de date online STRING a fost utilizată pentru a construi o rețea PPI. Numărul de spermatozoizi, motilitatea spermatozoizilor și hormonii de testosteron din grupul de șobolani tratați cu ZnSO4 au crescut. ZnSO4 a îmbunătățit structura testiculară și anomaliile spermatogenezei cauzate de obezitate. Analiza proteomică a arătat că au existat 401 proteine exprimate diferențiat într-un total de 6 probe de spermă din grupul tratat cu ZnSO4 și din grupurile de obezitate. Proteinele diferențiate au fost introduse în site-ul DAVID. Cele 341 de proteine identificate au fost apoi clasificate în funcție de funcțiile lor biologice. Analiza KEGG a arătat că căile de semnal îmbogățite au inclus glicoliza/gluconeogeneza, metabolismul carbonului, ciclul citratului, metabolismul acizilor grași și metabolismul piruvatului. Unele proteine s-au dovedit a fi asociate cu căile de degradare a valinei, leucinei și izoleucinei. Analiza STRING a obținut 36 proteine de nod. Analiza Cytoscape a arătat că aceste proteine au participat în principal la nouă rețele, inclusiv procesul metabolic, oxidare-reducere, respirație aerobă, splicingul ARN și conjugarea glutationului. ZnSO4 poate îmbunătăți fertilitatea șobolanilor masculi obezi prin reglarea expresiei proteinelor legate de metabolism, inflamație și maturarea spermatozoizilor.
1. Introducere
Obezitatea este asociată cu infertilitatea masculină. Există o anumită coerență în timp între creșterea ratei infertilității masculine, scăderea calității materialului seminal și creșterea ratei obezității . Obezitatea duce la modificări patologice în ultrastructura testiculară, iar apoptoza celulelor spermatogene este semnificativ crescută . Scăderea numărului de spermatozoizi maturi poate fi unul dintre motivele care conduc la capacitatea spermatogenă scăzută a persoanelor obeze.
Există tulburări ale metabolismului oligoelementelor la persoanele obeze. Nivelul perturbat al metabolismului oligoelementelor în organism va induce efecte corespunzătoare asupra metabolismului lipidic. În sistemul reproducător masculin, ionii de zinc sunt distribuiți în principal în testicule, epididim, prostată și spermă. Zincul este un marker al funcției prostatei. În plus, acesta reglează funcția spermei, acționează ca un cofactor pentru majoritatea reacțiilor enzimatice și ajută la menținerea motilității spermatozoizilor. Zincul joacă, de asemenea, un rol important în dezvoltarea testiculară și în formarea spermatozoizilor . Deficitul de zinc sporește semnificativ apoptoza celulelor germinale în testiculul de șoarece și provoacă oprirea spermatogenezei și afectarea fertilizării . Studiile au arătat că bărbații obezi au o probabilitate de 3,5 ori mai mare de a avea oligozoospermie decât bărbații cu greutate normală . Suplimentarea cu zinc poate reduce greutatea persoanelor obeze. Starea glicemiei (glicemia la jeun), parametrii lipidici din sânge (colesterolul total, nivelul trigliceridelor, colesterolul lipoproteinelor cu densitate mare și colesterolul lipoproteinelor cu densitate mică) și tensiunea arterială sunt îmbunătățite după suplimentarea cu zinc . Preparatul oral de zinc poate îmbunătăți conținutul de zinc din plasma seminală, poate promova transformarea proteinei nucleare a spermatozoizilor (adică de la lizină la arginină) și poate inhiba depolimerizarea prematură a nucleului spermei. Poate îmbunătăți motilitatea spermatozoizilor și calitatea materialului seminal al pacienților infertili fără efecte secundare evidente . Cu toate acestea, aplicarea proteomicii în înțelegerea efectelor tratamentului cu ZnSO4 asupra proteinelor spermatozoizilor în obezitate este încă limitată și este necesară o explorare suplimentară.
În acest studiu, au fost investigate efectele a trei doze diferite de ZnSO4 asupra spermatogenezei și a nivelurilor hormonale ale șobolanilor obezi. Mecanismul care stă la baza acestui efect a fost analizat în continuare prin analiză proteomică.
2. Materiale și metode
2.1. Animale
Șobolanii Sprague Dawley în vârstă de 7 săptămâni (cântărind 180-200 g) au fost achiziționați de la Centrul de Animale Experimentale al Universității Medicale din Hebei. Aceștia au fost menținuți pe un ciclu de 12 h de întuneric/lumină într-o cameră cu aer controlat (temperatură, ; umiditate, ) cu acces liber la apă și hrană pentru animale. Toate procedurile de experimentare pe animale au fost aprobate de Comitetul de Etică al Institutului de Știință și Tehnologie a Planificării Familiei din Hebei.
2.2. Stabilirea modelului de obezitate, gruparea animalelor și prelevarea de probe
Șobolanii au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri: grupul de hrană normală (15 animale pe grup) și grupul de model de obezitate (30 de animale pe grup). Fiecare grup a fost hrănit cu dietele corespunzătoare timp de 8 săptămâni, și anume, o dietă normală de chow pentru grupul normal și o dietă bogată în grăsimi pentru grupul model de obezitate. Greutatea corporală a șobolanilor a fost cântărită săptămânal și înregistrată timp de 8 săptămâni. Modelul de obezitate a fost considerat un succes atunci când greutatea corporală medie a grupului model a fost de 1,2 ori mai mare decât cea a grupului de control. Lungimea șobolanilor a fost măsurată (de la vârful nasului până la anus), iar indicele Lee a fost calculat prin formula .
După stabilirea modelului de obezitate, șobolanii model au fost împărțiți aleatoriu în două grupuri: grupul de obezitate și grupul tratat cu ZnSO4. Șobolanii din grupul tratat cu ZnSO4 au primit ZnSO4 (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d) timp de 4 săptămâni prin gavare orală. La sfârșitul experimentului, au fost măsurate greutatea corporală, greutatea testiculară, greutatea epididimală și grăsimea peritesticulară a fiecărui grup, iar sângele a fost prelevat din aorta abdominală. Probele de spermă au fost recoltate din epididimul caudal. Testiculele au fost îndepărtate.
2.3. Numărul de spermatozoizi și motilitatea spermatozoizilor
Epididimul stâng al fiecărui șobolan a fost recoltat imediat după sacrificare și a fost transferat într-un tub care conținea 1 ml de soluție salină caldă (37°C). Acestea au fost apoi agitate la 37°C timp de 5 min pentru a permite dispersarea spermatozoizilor. Aproximativ 10 μL de suspensie de spermatozoizi diluați au fost transferați în fiecare cameră de numărare a hemocitometrului pentru a determina concentrația și motilitatea spermatozoizilor. Motilitatea a fost măsurată ca procent de spermatozoizi mobili (gradul a+b) din totalul spermatozoizilor.
2.4. Determinarea glucozei serice la post, a lipidelor din sânge și a insulinei
Nivelurile de colesteroli totali, trigliceride, lipoproteine cu densitate scăzută și lipoproteine cu densitate mare din ser au fost măsurate pe un analizor Siemens Centaur XP cu ajutorul unui kit de imunodozare cu microparticule chemiluminiscente (Medical System Biotechnology Co., LTD). Glicemia serică la post a fost măsurată cu ajutorul unui kit de detectare a glucozei (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, China) pe un analizor ACCUTE TBA-40FR (Toshiba Medical Systems Co., Tokyo, Japonia). Nivelurile serice de insulină au fost determinate prin imunoanaliză prin chemiluminiscență pe un sistem UniCel DxI 800 (Beckman Coulter, CA, SUA) cu reactivi corespunzători (Beckman Coulter, CA, SUA).
2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Nivelul de leptină a fost determinat cu ajutorul kiturilor ELISA (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, China). După terminarea reacției, absorbția a fost citită la 450 nm.
2.6. Colorarea HE
Testiculele au fost fixate în soluție Bouin’s peste noapte. Testiculele au fost apoi deshidratate cu alcool și încorporate în parafină. Probele au fost secționate la o grosime de 5 μm și colorate cu colorare HE. Spermatogeneza testiculară a fost observată la un microscop opticular.
2.7. Măsurarea hormonilor androgeni
Nivelurile serice de estrogen și testosteron au fost măsurate pe un analizor Siemens Centaur XP prin imunoanaliză cu microparticule chemiluminescente. Kitul de detecție a fost achiziționat de la Siemens Healthcare Diagnostic Inc. și Cayman Chemical, Michigan, SUA.
2.8. Cromatografie lichidă-spectrometrie de masă
Eșantioanele de proteine spermatice utilizate în acest studiu au provenit de la cele trei grupuri (grupul normal, grupul modelului de obezitate și grupul tratat cu ZnSO4). Probele de spermă au fost recoltate din epididimul caudal. Pe scurt, proteinele au fost extrase cu un tampon de lizat cu 8 M uree, 10 mM DTT și inhibitor de protează. Sonicare a fost efectuată timp de 3-5 minute. Supernatantul a fost colectat după o centrifugare la 20000 g timp de 10 minute la 4°C, iar proteinele au fost cuantificate prin metoda Bradford. Proteinele extrase au fost incubate cu 100 mM TEAB la 100 μL și apoi cu 200 mM TCEP la 55°C timp de 1 h. După aceea, s-au adăugat 5 μL de 375 mM iodoacetamidă (IAA). După incubarea în întuneric timp de 30 min, s-a adăugat acetonă prerăcită și s-a incubat peste noapte la -20°C. Supernatantul a fost îndepărtat cu grijă după o centrifugare la 8000 g la 10°C timp de 10 min, iar lizatul a fost lăsat la temperatura camerei timp de 2-3 min pentru a se usca. În cele din urmă, s-au amestecat 100 μg de proteină, 100 μL de soluție de TEAB 100 mM și proteină în proporție de enzimă tripsină (1 : 50) și s-a efectuat digestia enzimatică peste noapte la 37°C.
Cromatografie lichidă-spectrometrie de masă: s-au prelevat probe parțial digerate și s-au dizolvat în soluția A (2% ACN/98% H2O/0,1% FA). După centrifugare la 20000 g timp de 30 de minute, s-a luat supernatantul și secvența proteică a fost detectată cu ajutorul spectrometrului de masă EASY-nLC liquid phase-Q Exactive (American Thermo Fisher).
Condițiile de spectrometrie de masă au fost: 90 min pentru timpul de achiziție a datelor, 2 kV pentru tensiunea de pulverizare, 320°C pentru temperatura capilară, 27% pentru energia de coliziune normalizată și 300-1400 Da pentru intervalul de masă de colectare. Parametrii principali au fost 70000 pentru rezoluție, 36 pentru ținta AGC, 60 ms pentru IT maxim și profil pentru tipul de date spectrale. Parametrii secundari au fost 17500 pentru rezoluție, 54 pentru ținta AGC, 80 ms pentru IT maximă și 3,0 m/z pentru fereastra de izolare.
2,9. Recuperarea datelor
În motorul de căutare MaxQuant 1.5.2.8, prima eroare este de 20 ppm, a doua eroare este de 0,02 Da. Modificarea fixă este după cum urmează. Cisteina este modificată în Carbamidometil-Cys, iar modificarea variabilă este după cum urmează: Oxidarea-M, digestia LysisC sau Trypsin, sau Glu-C. Digestia enzimatică permite până la 2 situsuri lipsă. Umplerea lacunelor de date, normalizarea și depistarea diferențelor () au fost toate efectuate utilizând setările standard ale software-ului Perseus. Un total de 1344 de proteine au fost identificate și cuantificate în 6 probe din ambele grupuri. Au fost obținute informații calitative și cantitative ale grupului Zn și G asupra proteinelor diferențiale. Software-ul Perseus a efectuat -testul și analiza de semnificație asupra rezultatelor cantitative și a rapoartelor de proteine. Lista proteinelor diferențiale obținută este următoarea: un total de 401 proteine diferențiale semnificative au fost obținute prin rezultatele -testului și rezultatele analizei distribuției diferențiale.
2.10. Analiza GO (Gene Ontology) și KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
Proteinele diferențiale au fost importate în site-ul DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) (https://david.ncifcrf.gov/) pentru extragerea bioinformatică de bază. Instrumentele web furnizate de DAVID au fost utilizate pentru a căuta termenii de adnotare funcțională și căile care au fost îmbogățite în proteinele identificate mai sus, inclusiv componenta celulară, funcția moleculară și procesul biologic.
2.11. Analiza rețelei de interacțiune a proteinelor
Proteinele diferențiate depistate au fost importate în baza de date online STRING (https://string-db.org/) pentru analiză. A fost desenată harta rețelei de interacțiune genetică diferențială. Datele rețelei interactive au fost exportate în software-ul Cytoscape 3.2 pentru a determina proteina nodului central al rețelei.
2.12. Analiza statistică
Datele au fost afișate ca . Analiza statistică a fost efectuată în SPSS22.0 utilizând analiza varianței (ANOVA) cu o valoare < 0,05 considerată semnificativă din punct de vedere statistic.
3. Rezultate
3.1. Modificări ale parametrilor materialului seminal și ale nivelului hormonului testosteron în spermă după tratamentul cu ZnSO4
În comparație cu grupul de control, greutatea corporală, grăsimea peritesticulară, indicele Lee, colesterolul total, trigliceridele, lipoproteinele cu densitate mare și leptina șobolanilor din grupul de obezitate și leptina șobolanilor din grupul tratat cu ZnSO4 au crescut semnificativ. În comparație cu grupul de control, lipoproteina cu densitate scăzută a șobolanilor din grupul de obezitate a scăzut semnificativ. Comparativ cu grupul de obezitate, greutatea corporală, grăsimea peritesticulară și indicele Lee au scăzut în grupul tratat cu ZnSO4, iar diferența a fost semnificativă din punct de vedere statistic (tabelul 1). Pentru a detecta efectele ZnSO4 asupra fertilității șobolanilor, fiecare grup de parametri ai materialului seminal a fost mai întâi evaluat în conformitate cu criteriile OMS 2010 . Numărul de spermatozoizi și motilitatea spermatozoizilor au fost inhibate în grupul de obezitate, așa cum se arată în tabelul 2. În comparație cu grupul de obezitate, numărul de spermatozoizi și motilitatea spermatozoizilor la șobolanii tratați cu ZnSO4 au crescut, sugerând că ZnSO4 îmbunătățește parametrii materialului seminal la șobolanii obezi. Obezitatea în sine poate provoca o creștere a lipidelor din sânge, dar rezultatele noastre au arătat că nivelul glicemiei, al lipidelor din sânge și al insulinei nu a atins nivelul de diabet. Se poate considera că factorii de confuzie ai complicațiilor diabetice au fost excluși. În plus, am detectat nivelul testosteronului seric. Rezultatele au arătat că hormonii de testosteron au crescut în grupul tratat cu ZnSO4 în comparație cu grupul de obezitate (tabelul 2). Astfel, tratamentul cu ZnSO4 ar putea îmbunătăți calitatea materialului seminal al șobolanilor obezi.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Nota: # în comparație cu controlul normal; în comparație cu obezitatea.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
Nota: în comparație cu controlul normal; în comparație cu obezitatea.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.2. Tratamentul cu ZnSO4 îmbunătățește recuperarea afectării testiculare induse de obezitate
Subiectiv, am efectuat analiza histologică a țesutului testicular, iar rezultatele au fost prezentate în figura 1. Conform histologiei testiculare, grupul normal a prezentat o spermatogeneză normală [figurile 1(a) și 1(d)], în timp ce grupul cu obezitate a prezentat o spermatogeneză perturbată, deoarece lumenul tubului seminifer era aproape gol [figurile 1(b) și 1(e)]. Așa cum ne așteptam, grupul tratat cu ZnSO4 a prezentat o ameliorare semnificativă în comparație cu grupul obezității în ceea ce privește histologia testiculelor, cu apariția celulelor Sertoli și Leydig normale și spermatogeneza neîntreruptă [figurile 1(c) și 1(f)]. Astfel, ZnSO4 poate îmbunătăți structura testiculară și anomaliile de spermatogeneză cauzate de obezitate.
3.3. Clasificarea a 341 de proteine din spermă prin bioinformatică: Componentă celulară, funcție moleculară și proces biologic
Pentru a determina proteinele exprimate diferențiat, s-a efectuat o analiză proteomică. Un total de 1344 de proteine au fost identificate și cuantificate într-un total de 6 probe de spermă din grupul tratat cu ZnSO4 și din grupul obezitate. Software-ul Perseus a efectuat -testul și analiza de semnificație diferențială asupra rezultatelor cantitative și a rapoartelor de proteine. S-a obținut un total de 401 proteine semnificative. Proteinele diferențiale au fost introduse în site-ul DAVID pentru diferențele dintre grupul tratat cu ZnSO4 și grupul de obezitate în ceea ce privește funcția proteinelor. În clasificarea GO, au fost analizate 371 de proteine, iar 30 de proteine nu au corespuns. Cele 341 de proteine identificate au fost apoi clasificate în funcție de funcțiile lor biologice. Am folosit instrumentele web furnizate de DAVID pentru a căuta termenii de adnotare funcțională și căile care au fost îmbogățite în proteinele identificate mai sus. Rezultatele acestor analize au fost prezentate în figura 2. Ne-am axat pe ontologia componentei celulare, a funcției moleculare și a procesului biologic pentru analiza îmbogățirii termenilor de adnotare funcțională cu și .
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
În grupul „componentă celulară” (Figura 2(a)), analiza categoriilor a arătat că 59% dintre proteinele cu diferențe semnificative erau componente ale organitelor, iar 60,7% dintre acestea erau constituenți ai organitelor. În plus, 29,6% dintre proteine aparțineau unui complex macromolecular. Analiza termenilor GO „funcție moleculară” a arătat că 22% dintre proteine au fost clasificate ca proteine cu activitate catalitică (Figura 2(b)). Celelalte proteine au putut fi clasificate ca fiind legate de proteine, legate de ARNr și legate de enzime. În ceea ce privește baza de date privind „procesul biologic” [Figura 2(c)], majoritatea proteinelor de 24% au fost asociate cu procesul metabolic. În plus, proteinele erau legate de transport, transducție de semnal, moarte celulară, adeziune celulară, procesul sistemului imunitar și reproducere. Rezultatele analizei căilor de semnal (Figura 2(d)) cu proteine concentrate și îmbogățite sunt următoarele. Multiple căi metabolice, cum ar fi glicoliza/gluconeogeneza, metabolismul carbonului, ciclul citratului (ciclul TCA), metabolismul acizilor grași și metabolismul piruvatului au fost perturbate și afectate, iar unele proteine s-au dovedit a fi asociate cu căile de degradare a valinei, leucinei și izoleucinei.
3.4. Efectele zincului sunt identificate în continuare de proteinele spermatozoizilor exprimate diferențiat
Analiza de cuantificare a fost efectuată pentru a compara nivelurile de proteine între cele trei grupuri. În proteinele diferențiale, am selectat proteinele metabolice, proteinele asociate transportului de zinc și proteinele nodurilor din rețea (tabelul 3). Proteinele cu modificări semnificative din punct de vedere statistic au fost prezentate în figura 3. Aceste proteine au fost ARG2, COX5B, ZNT1, LYAR și TM165. Comparativ cu grupul de obezitate, expresia ARG2, COX5B și ZNT1 în grupul tratat cu ZnSO4 a scăzut semnificativ, în timp ce expresia LYAR și TM165 a crescut semnificativ.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.5. Rețeaua de interacțiune proteică diferențială este stabilită cu ajutorul bazei de date STRING Network
STRING este un software de analiză online care analizează și prezice interacțiunea dintre proteinele cunoscute. Software-ul STRING stabilește un mecanism de punctare pentru a face ponderi corespunzătoare pe diferite surse de date și, în final, oferă un scor cuprinzător și apoi construiește o hartă a rețelei de interacțiuni proteină-proteină . Cele 341 de proteine diferențiale depistate au fost importate în baza de date online STRING (http://string-db.org/) pentru analiză, iar 341 de proteine au fost identificate și a fost generată harta rețelei de interacțiune genetică diferențială. După aceea, datele rețelei interactive au fost exportate în software-ul Cytoscape 3.2 pentru a determina proteina nodului central al rețelei. Se poate observa că rețeaua de compoziție proteică diferențială este complexă (figura 4). Am folosit apoi pluginul Cytoscape pentru a analiza proteinele nodurilor din rețea, iar în urma analizei au fost obținute un total de 36 de proteine noduri (tabelul 3). Dintr-o listă de rețele de top generată cu ajutorul STRING, am selectat sub-rețelele. Analiza Cytoscape a arătat că aceste proteine au participat în principal la nouă rețele, inclusiv procesul metabolic, oxidare-reducere, respirația aerobă, splicingul ARN și conjugarea glutationului.
4. Discuție
OMS definește o persoană cu o acumulare anormală sau excesivă de grăsime ca fiind supraponderală sau obeză, iar această stare constituie o amenințare din ce în ce mai mare pentru sănătatea oamenilor la nivel mondial . Unele rapoarte arată că rata obezității este în creștere rapidă , ceea ce nu numai că sporește riscul de îmbolnăvire, dar, în paralel, crește și riscul pacienților de a dezvolta tulburări de reproducere. Pe măsură ce funcția de reproducere a bărbaților se deteriorează la nivel global , tot mai multe persoane au realizat că obezitatea scade calitatea materialului seminal. Odată cu creșterea IMC, parametrii materialului seminal sunt modificați, modificând astfel structura fizică și moleculară a spermatozoizilor . Studiile anterioare au constatat că concentrația de spermatozoizi și numărul total de spermatozoizi motili au fost afectate în mod negativ de un IMC ridicat . În studiul de față, șobolanii din grupurile de obezitate au prezentat o scădere semnificativă a concentrației de spermatozoizi și a motilității spermatozoizilor în comparație cu cei din grupul cu greutate normală, în timp ce ZnSO4 a îmbunătățit parametrii spermei în comparație cu cei din grupul de obezitate.
Dezechilibrele hormonilor sexuali pot afecta reproducerea masculină, iar o stare de supraponderabilitate poate afecta nivelurile hormonale la bărbați . În același timp, studiile au arătat că obezitatea este strâns legată de tulburările endocrine, cum ar fi anomaliile hormonilor sexuali . Obezitatea la bărbați are un impact negativ asupra potențialului reproductiv masculin din cauza modificărilor nivelurilor hormonale . Prin urmare, am testat nivelurile serice în fiecare grup. Hormonii de testosteron au crescut în grupul tratat cu ZnSO4 în comparație cu grupurile normale și obezitate. Se pare că tratamentul cu ZnSO4 a crescut semnificativ nivelul hormonilor androgeni pentru a se alinia la nivelul grupului de control normal. Reducerea greutății corporale și a nivelului de lipide din sânge la șobolanii tratați cu ZnSO4 poate repara celulele Leydig, crescând astfel nivelul de testosteron. Ca o consecință, se poate regenera un sistem reproducător masculin funcțional, ajutând la spermatogeneza și la regenerarea structurii testiculare . În mod evident, histologia testiculară a grupului tratat cu ZnSO4 a fost îmbunătățită, celulele Sertoli și Leydig fiind regenerate, iar spermatozoizii din lumen restaurați. Prin urmare, o proteomică comparativă la scară largă oferă o abordare eficientă pentru a identifica orice diferență de expresie a proteinelor între grupurile tratate cu obezitate și cele tratate cu ZnSO4. Studiul nostru a identificat diferențele în profilurile de expresie a proteinelor între spermatozoizii fertili normali și spermatozoizii din grupurile tratate cu ZnSO4.
Analiza de adnotare GO a arătat că cele 24% dintre proteine au fost asociate cu procesul metabolic și 22% dintre proteine au fost clasificate ca proteine cu activitate catalitică. Celelalte proteine au fost clasificate ca legând proteine, legând ARNr și legând enzime, inclusiv legând ATP. Este bine cunoscut faptul că proteinele care se leagă de ATP joacă un rol fundamental în procesele biologice, ceea ce indică schimbări în procesele sintetice și metabolice. Mitocondriile sunt organite care furnizează energie (ATP) celulelor. Mitocondriile sunt, de asemenea, ținta principală a stresului oxidativ. În organismul masculin, mitocondriile sunt principala centrală energetică în procesul de maturare a celulelor spermatogene și, de asemenea, furnizează energie pentru spermatozoizi după ejaculare. Prin urmare, atunci când apare stresul oxidativ la bărbații obezi, mitocondriile din spermatozoizi pot fi foarte mult afectate. Sperma este sensibilă la stresul oxidativ și nu are capacitatea de a repara daunele. Dieta bogată în grăsimi induce stresul oxidativ la șobolanii obezi, ceea ce induce deteriorarea membranei mitocondriale a spermatozoizilor și afectează funcția mitocondrială . Egwurugwu et al. au concluzionat că sulfatul de zinc a avut unele efecte pozitive semnificative asupra androgenilor și calității spermei la doze fiziologice. Cu toate acestea, a fost dăunător la doze mai mari.
Se știe că ARG2 se localizează în mitocondrii . De asemenea, joacă un rol crucial în producția de ornitină, care este un precursor al prolinei, hidroxiprolinei și poliaminei și este esențială pentru proliferarea celulară. Obezitatea și bolile asociate acesteia sunt caracterizate de niveluri scăzute de inflamație cronică . ARG2 promovează răspunsurile proinflamatorii în macrofage și contribuie la evidențierea aterosclerozei și a rezistenței la insulină legate de obezitate . Credem că obezitatea timpurie poate duce la reglarea în sus a arginazei, ceea ce duce la modificări sistemice ale arginazei și ale metaboliților argininei. Upreglementarea ARG2 în grupul obez poate fi asociată cu proliferarea celulară și inflamația cronică cauzată de obezitate. Arginaza îmbunătățește anomaliile lipidelor hepatice și ale grăsimii sistemice induse de obezitate prin inhibarea activării căilor implicate în metabolismul hepatic al trigliceridelor și în funcția mitocondrială .
Dintre aceste proteine, COX5B în special este de mare interes și este legată de funcția mitocondrială și de producția de energie celulară . Citocrom oxidaza (COX, Complexul IV) este o enzimă a lanțului mitocondrial de transport al electronilor care se află în membrana interioară mitocondrială, iar activitatea sa este necesară pentru a genera forța motrice a protonilor care determină sinteza ATP în aval. Este una dintre cele trei izoforme mitocondriale ale citocrom oxidazei, adică Complexul IV al lanțului respirator mitocondrial. COX5B este implicată în etapa finală a fosforilării oxidative, cu producerea de H2O și menținerea gradientului electrochimic necesar pentru a produce ATP. Astfel, nivelurile reduse de ARG2 și COX5B la șobolanii tratați cu sulfat de zinc pot sugera un efect indus de zinc asupra fertilității la șobolanii obezi, în special în regenerarea testiculară, spermatogeneza și motilitatea spermatozoizilor.
Câteva proteine exprimate diferențiat identificate în acest studiu sunt implicate în procesul de transport al zincului. De exemplu, Elgazar et al. au constatat că ZnT1 este prezentă în membrana plasmatică și în citoplasma celulelor de susținere. Studiile au arătat că Znt1 joacă un rol important în homeostazia zincului la șoarecii adulți . Factorul de transcripție-1 sensibil la metale (MTF-1) joacă un rol în coordonarea răspunsurilor celulare la homeostazia metalelor și la stresul oxidativ. MTF-1 este un factor de transcripție dependent de zinc care stimulează genele metalotioneinei și ale transportatorului de zinc-1 (ZNT-1) odată cu creșterea concentrației de zinc . Foster și colab. au arătat că expresia relativă a ARNm al transportatorului de zinc a fost foarte variabilă. ZnT1 este cel mai abundent în testicule și are interacțiuni în transportul zincului prin membrana plasmatică. Noh et al. au raportat că nivelurile ARNm ZnT1 au fost ușor crescute la femeile obeze, iar modificările transportatorului de zinc pot fi, de asemenea, asociate cu stările inflamatorii legate de obezitate.
Omologul reactiv la anticorpi Ly1 (LYAR) a fost descris pentru prima dată de Su et al. ca un ADNc care codifică o proteină cu deget de zinc izolată din linia de leucemie cu celule T de șoarece . Gena Lyar, despre care se știe că este exprimată abundent în testicule, codifică o proteină nucleolară care conține un motiv de deget de zinc C2HC de tip LYAR și trei semnale de localizare nucleară. Lee și colab. au constatat că proteina LYAR era prezentă în spermatocite și spermatozoizi, dar nu și în spermatozoizi. Cu toate acestea, am detectat expresia LYAR în spermă, iar expresia sa a scăzut în sperma șobolanilor obezi și a crescut în grupurile tratate cu ZnSO4. LYAR este identificat ca fiind asociat cu ribozomii citoplasmatici în celulele germinale masculine și canceroase și este implicat în procesarea ARN-ului preribosomal în cadrul nucleului . LYAR este un modulator al uneia dintre cele două etape de bază ale inițierii traducerii în celulele germinale masculine de mamifere și în anumite tipuri de tumori . LYAR suprimă în mod considerabil transcrierea genelor de stres oxidativ, inclusiv SLC7A11, HMOX1 și CHAC1. Oncoproteina Myc crește expresia LYAR prin activarea transcrierii genei sale, iar creșterea LYAR, la rândul său, protejează celulele canceroase împotriva apoptozei mediate de stresul oxidativ prin reducerea expresiei genei CHAC1 .
Proteina transmembranară 165 (TM165) este o proteină transmembranară Golgi , iar deficitul său provoacă o tulburare congenitală de glicozilare. TM165 este supraexprimată atât din punct de vedere transcripțional cât și al traducerii în carcinomul hepatocelular și este asociată cu capacitatea invazivă a carcinomului hepatocelular . Cu toate acestea, datele obținute în cadrul unui studiu recent oferă mai multe indicii privind implicarea lor în homeostazia calciului și a manganului . TM165 furnizează Ca2+ și Mn2+ complexului Golgi în schimbul H+ pentru a susține funcțiile lactozei-sintetazei și, eventual, ale altor glicoziltransferaze . Proteina umană Golgi TM165 poate transporta calciu și mangan în celule de drojdie și bacteriene. Studiul nostru a constatat că expresia TM165 la șobolanii obezi a scăzut și a crescut după suplimentarea cu zinc, sugerând că TM165 a crescut după suplimentarea cu zinc.
5. Concluzii
În concluzie, rezultatele acestui studiu oferă dovezi că ZnSO4 poate îmbunătăți nivelurile hormonale, regenerarea testiculară și fertilitatea. Analiza proteomică arată, de asemenea, că ZnSO4 poate îmbunătăți fertilitatea șobolanilor masculi obezi prin reglarea expresiei proteinelor legate de metabolism, inflamație, maturarea spermatozoizilor și alte interacțiuni.
Disponibilitatea datelor
Datele folosite pentru a susține concluziile acestui studiu sunt disponibile la cerere.
Dezvăluiri
Agenția finanțatoare nu a avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
Conflicte de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoștințe
Acest studiu a fost sprijinit de proiectul de formare a talentelor excelente în medicină clinică și de cercetare de bază finanțat de guvernul provincial Hebei (Grant nr. 20170183).
.