Moartea celulară este crucială pentru executarea corectă a proceselor normale și fiziopatologice și este omniprezentă în sistemele biologice.

Formele programate de moarte celulară sunt responsabile de producerea modelelor morfologice în timpul dezvoltării, de selecția negativă în timpul imunității și de „cursa moleculară a armelor” care are loc între genele virale și cele ale gazdei în timpul infecției, precum și de leziunile tisulare care apar cu factori de stres din mediul înconjurător, cum ar fi genotoxinele.

Alterările din cadrul acestor căi de moarte celulară se pot manifesta ca boli, inclusiv cancer, tulburări degenerative și sindromul imunodeficienței dobândite (SIDA). Capacitatea celulelor tumorale de a eluda moartea celulară programată este un semn distinctiv al majorității tipurilor de cancer.

În ultimii ani a devenit clar că simpla măsurare a semnelor individuale ale celulelor muribunde, cum ar fi fragmentarea nucleară sau permeabilitatea membranei, nu este suficientă pentru a face distincția între diferitele căi de moarte celulară, care includ apoptoza, moartea celulară autofagă și necroza.

Ceea ce este necesar este o evaluare multiparametrică a morții celulare care să dezvăluie evenimentele mecaniciste care au loc „în spatele scenei”. Conform recomandărilor Comitetului de nomenclatură privind moartea celulară din 2009, procesele legate de moartea celulară (apoptoză, necroză, autofagie) pot fi clasificate în funcție de aspectul morfologic, criterii enzimologice, aspecte funcționale și caracteristici imune.

Moartea celulară sub diverse forme

Apoptoza

Apoptoza se referă la un program de sinucidere celulară dirijat de gene. O mare varietate de proteine celulare, inclusiv receptori de suprafață celulară, proteaze și componente mitocondriale, reglează un echilibru delicat între supraviețuirea celulară și moartea prin apoptoză. Mutațiile din cadrul acestor proteine pot înclina echilibrul, ducând la supraviețuirea și proliferarea necontrolată a celulelor tumorale. Prin urmare, descoperirea mecanismelor de apoptoză poate duce la noi strategii de exploatare a acestei forme de moarte celulară în scopuri terapeutice.

Apoptoza este însoțită de o reducere a volumului celular, condensare nucleară, fragmentare a ADN-ului, sângerare a membranei plasmatice și înghițire de către fagocite. În plus, apoptoza implică, de obicei, permeabilizarea membranei mitocondriale, urmată de activarea cascadei caspazelor; cu toate acestea, pot fi activate alternativ proteaze care nu sunt caspaze.

Necroza

Necroza a fost considerată în mod istoric ca o formă pasivă de moarte celulară. Cu toate acestea, date recente sugerează că necroza poate fi, de asemenea, o formă alternativă de moarte celulară programată a cărei activare poate avea consecințe importante, cum ar fi inducerea unui răspuns inflamator. Necroza și apoptoza sunt foarte distincte din punct de vedere morfologic. Necroza este însoțită de o creștere a volumului celular, de umflarea organitelor, de ruperea membranei plasmatice și de pierderea conținutului intracelular.

În ceea ce privește diferența dintre apoptoză și necroză, diferitele metode de distincție între moartea celulară apoptotică și necrotică se bazează pe trăsături caracteristice care pot fi vizualizate și/sau măsurate, cum ar fi dimensiunea celulei, fragmentarea celulară și scindarea ADN-ului.

Autofagia

Autofagia este un proces homeostatic de degradare foarte bine reglat, prin care celulele își distrug propriile componente prin intermediul mașinăriei lizozomiale și le reciclează. Acest proces este asociat cu diverse boli, inclusiv cu boala Alzheimer, îmbătrânirea, cancerele și boala Crohn. În unele cazuri, autofagia crescută contribuie la moartea celulară prin intermediul unei încrucișări extinse cu căile de semnalizare pro-apoptotică. Înțelegerea corelației dintre autofagie și moartea celulară apoptotică face obiectul unui număr mare de cercetări, în special în biologia tumorală.

Autofagie vs Apoptoză

Moartea celulară autofagică este definită morfologic ca fiind moartea celulară care are loc în absența condensării cromatinei, dar este însoțită de vacuolizarea masivă a citoplasmei. Spre deosebire de apoptoză, autofagia are o asociere mică sau deloc cu fagocitele. În timpul acestei forme de moarte celulară, materialul citoplasmatic este sechestrat în autofagosomi pentru a fi degradat de către lizozomi.

Se știe acum că există o legătură încrucișată între căile apoptotică și autofagie, iar studiile au arătat că BCL2, care este un regulator important al apoptozei, este, de asemenea, un regulator important al căii autofagiei.

Progresele recente în biologia chimică, analiza căilor și citometria sofisticată au permis o înțelegere mai profundă a markerilor moleculari și a modificărilor celulare care caracterizează fiecare cale de moarte celulară. Mai mult, evoluția tehnologiei a făcut posibilă, de asemenea, efectuarea multora dintre aceste evaluări ca experimente de rutină pe bancă, în linie cu analizele din aval. Împreună, aceste progrese au transformat studiul morții celulare în disecția unor rețele de semnalizare nuanțate care sunt integrate în sisteme complexe.

Una dintre caracteristicile pivotale ale morții celulare pe care comunitatea științifică încearcă să o disece este punctul de neîntoarcere de-a lungul acestor căi nuanțate. Există atât puncte reversibile, cât și ireversibile de-a lungul fiecărei căi de semnalizare a morții celulare, iar determinarea locului în care se află punctul de tranziție în diverse contexte este de mare importanță din punctul de vedere al încercării de a interveni în proces. Indiferent de tipul de moarte celulară, odată ce celula a depășit punctul de neîntoarcere, moartea nu mai poate fi împiedicată.

Analiza morții celulare

Pentru a diseca, caracteriza și diferenția între diferitele forme de moarte celulară, sunt necesare două tipuri de criterii: descriptive (de exemplu, imagistice) și funcționale (de exemplu, inhibarea căilor). De exemplu, fragmentarea ADN-ului și activarea caspazei pot ajuta fiecare la definirea apoptozei, dar aceste analize nu sunt definitive atunci când sunt utilizate în mod izolat, deoarece apoptoza poate avea loc fără fragmentarea ADN-ului, iar activarea caspazei este, de asemenea, legată de alte procese biologice.

De aceea, moartea celulară ar trebui întotdeauna măsurată folosind metode multiple, de preferință în aceeași probă, combinând testele biochimice și morfologice atunci când este posibil. O serie de tehnologii pot furniza informații valoroase cu privire la diferitele căi de moarte celulară, inclusiv imagistica, TUNEL, testele bazate pe imunologie, citometria în flux, citometria bazată pe imagistică și tehnologiile de imagistică a celulelor aderente. Cu toate acestea, există câteva dezavantaje comune, inerente metodelor actuale de investigare a morții celulare, care le pot limita utilitatea.

De exemplu, tehnologii precum Western Blotting și ELISA nu sunt capabile să furnizeze modificări specifice per celulă, deși sunt foarte utile pentru colectarea de informații cu privire la modificarea totală a procesului. Anumite metode de imagistică pot avea limitări cu privire la faptul că un număr echivalent de celule sunt numărate de la o probă la alta sau dacă sunt numărate suficiente celule, ceea ce ar putea avea un impact asupra reproductibilității și/sau acurateței rezultatelor.

La celălalt capăt, metode precum citometria în flux multiparametrică sau citometria de imagistică pot fi foarte puternice și pot furniza date bogate în conținut pentru analizele de moarte celulară, dar aceste metode pot avea, de asemenea, limitări. De exemplu, accesul la instrumente poate fi limitat, poate fi nevoie de multă expertiză și formare, iar accesibilitatea poate fi o provocare.

Există o nevoie în industrie de metodologii ușor de utilizat, accesibile și la prețuri accesibile, care pot oferi în mod robust, precis și reproductibil răspunsuri la întrebări comune, de zi cu zi, pe care cercetătorii le investighează în domeniul sănătății și morții celulare. Mai jos sunt descrise metode consacrate și emergente pentru a discrimina în mod eficient între apoptoză, necroză și autofagie.

Imagistică

Moartea celulară este, în cele din urmă, un proces morfologic, iar standardul de aur pentru analiza acestui proces este vizualizarea celulelor. Atunci când moartea celulară este observată în cultură, devine foarte evident ceea ce se întâmplă. De exemplu, în timpul apoptozei, celulele se rotunjesc și par să fiarbă („blebbing”). Există mai multe abordări disponibile pentru vizualizarea morții celulare, inclusiv simpla vizualizare a celulelor în timp real în cultură, colorarea celulelor cu portocaliu de acridină (un colorant vital specific pentru celulele apoptotice), colorarea histologică a țesuturilor fixate și microscopia electronică. Există, de asemenea, noi opțiuni disponibile în citometria de imagine, așa cum este descris mai jos.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

Procedura Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) este o metodă foarte comună de examinare a fragmentării ADN care rezultă din apoptoză. TUNEL marchează capetele terminale ale ADN-ului care sunt scindate în regiunea de spațiere dintre nucleozomi în cromatină, iar aceste rupturi ale catenei de ADN sunt vizualizate prin microscopie optică. Deși TUNEL este un test foarte eficient pentru apoptoză, o limitare majoră a acestei abordări este faptul că TUNEL detectează celulele apoptotice în ultima etapă a procesului.

Activarea caspazelor

La nivel molecular, o serie de enzime cunoscute sub numele de caspaze sunt în mare parte responsabile pentru executarea căii de moarte celulară apoptotică, dar nu și necrotică. Ca răspuns la semnalele pro-apoptotice, caspazele participă la o serie de reacții care au ca rezultat scindarea substraturilor proteice, determinând dezasamblarea celulei. Caspazele există în fiecare celulă a organismului sub formă de proenzime latente. În timpul apoptozei, caspazele formează molecule de tetramere enzimatice active care pot activa sau inactiva substraturile lor.

Aceste enzime recunosc în mod specific o secvență de patru sau cinci aminoacizi de pe substratul țintă, care include un reziduu de acid aspartic ca țintă pentru scindare. Caspazele funcționează în alte procese biologice, cum ar fi imunitatea; de fapt, multe genomuri virale codifică pentru inhibitori direcți ai acestor caspaze. Caspazele pot fi detectate prin tehnici de imunoprecipitare sau de imunoblotting cu ajutorul anticorpilor specifici caspazelor sau prin utilizarea de substraturi fluorocrome care devin fluorescente în urma scindării de către caspază. În plus, implicarea caspaselor poate fi vizualizată prin tratarea culturilor vii cu Smac mimetic, un inductor foarte puternic de apoptoză.

Detectarea mitocondriilor

Mitocondriile sunt regulatori cheie ai proceselor de moarte celulară, cum ar fi apoptoza. Pierderea potențialului transmembranar intern mitocondrial este adesea, dar nu întotdeauna, observată ca fiind asociată cu primele etape ale apoptozei și se crede că are un rol în moartea celulară independentă de caspază. Testele bazate pe fluorescență concepute pentru a evalua starea funcțională a mitocondriilor sunt instrumente utile pentru examinarea rolului activității mitocondriale în cascada apoptozei.

Fosfatidilserina și anexina V

Fosfatidilserina (PS), limitată la frunza internă a membranei celulelor viabile, se translocă la suprafața expusă a membranei în timpul primelor etape ale apoptozei. Acest eveniment servește drept semnal de atac pentru celulele fagocitare. PS este expus în principal la petele de suprafață ale celulelor apoptotice. Annexina V are o afinitate ridicată pentru membranele care conțin PS încărcat negativ. Aceste evenimente pot fi vizualizate cu ajutorul citometriei în flux.

Citometria în flux

Testele de citometrie în flux pentru apoptoză au acum aproape 25 de ani. Primele teste de citometrie în flux pentru apoptoză au analizat modificările în dispersia înainte și laterală și fragmentarea ADN-ului în urma tratamentului cu etanol. În prezent, testele de citometrie în flux vizează aproape toate etapele apoptozei, de la primele modificări mitocondriale până la activarea caspazelor, modificările membranare și deteriorarea ADN-ului. Spre deosebire de testele anterioare, citometria în flux analizează apoptoza în celule individuale.

Citometria în flux multiparametrică este o abordare ideală pentru combinarea mai multor teste de moarte celulară. Detectarea caspazei FLICA, a anexinei V și a unui colorant de legare a ADN-ului cu efect permanent asupra celulei (de exemplu, iodura de propidiu) pot fi combinate într-un test puternic, în mai multe etape, pentru apoptoză (figura 1).

Combinarea acestor teste permite analizarea progresiei apoptozei și oferă o imagine mult mai bogată decât cea pe care o poate oferi un singur test.

O platformă de citometrie în flux de bancă poate, de asemenea, furniza instantaneu informații celulare cantitative pentru multe analize de sănătate celulară, moarte celulară, semnalizare celulară, imunologie și ciclu celular. Un astfel de instrument utilizează principiile citometriei microcapilare, care permite analiza eșantioanelor de dimensiuni mici. Platforma este închisă, prin care reactivii și software-ul sunt strâns împerecheați între ei pentru aplicații dedicate, cu scopul de a simplifica procesul și de a reduce complexitatea analitică pentru efectuarea și obținerea de date bazate pe citometrie.

Tehnologia permite analiza simultană a doi markeri și poate fi utilizată pentru a efectua studii de evoluție în timp și de răspuns la doză, oferind astfel o înțelegere mai profundă a mecanismelor în joc, precum și o imagine mai cuprinzătoare a procesului de moarte celulară (figura 2).

Până în prezent, există un singur test de citometrie în flux disponibil pentru a analiza autofagia, care implică măsurarea lanțului ușor 3 (LC3). LC3 este o proteină care se segregă în autofagozomi care fagocitează mitocondriile defuncte și alte organite intracelulare și, în cele din urmă, în lizozomi. Autofagia poate fi detectată prin citometrie de flux utilizând translocația proteinei fluorescente verzi (GFP)-LC3 (figura 3).

În acest test, o linie celulară este transfectată în mod stabil cu GFP-LC3. În timpul inducției, se adaugă un inhibitor de lizozimă pentru a bloca distrugerea autofagozomilor de către lizozomi. În cazul în care are loc autofagia, GFP-LC3 se va acumula în autofagosomi atunci când inhibitorul este prezent și nu va fi eliberat în mediu. Dacă nu are loc autofagia, atunci GFP-LC3 se va acumula în citoplasmă și va fi eliberată în mediu. GFP-LC3 asociată cu autofagosomele poate fi detectată în celulele intacte prin citometrie de flux.

Citometrie de imagine

Citometria de imagine permite colectarea simultană a datelor citometrice și a imaginilor celulare corelate, existând în prezent numeroase opțiuni pentru aceste tipuri de analize. Deoarece apoptoza este extrem de variabilă și pleiotropică, imagistica poate oferi verificarea faptului că apoptoza are loc și poate, de asemenea, să caracterizeze într-o anumită măsură procesul prin vizualizarea condensării cromatinei și a degradării citoscheletului. Citometria de imagine oferă, de asemenea, opțiuni suplimentare de analiză, inclusiv analiza pixel cu pixel, care sunt utile pentru analiza apoptozei. În plus, nu este necesară detașarea cu tripsină sau Accutase®, care poate „încurca” etichetele apoptotice.

Citometria de imagine permite, de asemenea, analiza celulelor aderente fără îndepărtarea celulelor de pe suportul lor. Din acest motiv, multe laboratoare utilizează citometria de imagine pentru analiza celulelor apoptotice aderente. Celulele aderente care sunt smulse din substratul lor, fie prin răzuire, fie prin tripsină, pot perturba fenotipul apoptotic sau chiar pot induce procesul apoptotic în sine. Citometria de imagine permite ca celulele aderente să rămână aderente pe toată durata analizei prin colorarea celulelor direct pe lama camerei. Este important de reținut că celulele aderente se vor rotunji odată ce au suferit apoptoza, astfel încât unele dintre celulele care se află în ultimele etape ale apoptozei pot fi pierdute.

Un sistem de citometrie de imagine bazat pe fluxuri oferă, de asemenea, o corelație directă între citometrie și imagistică și, astfel, combină analiza citometrică și morfologică. Într-un sistem de imagistică bazat pe flux, celulele nu sunt imaginate pe o lamă; mai degrabă, sunt imaginate direct în flux. Atunci când citometria și imagistica sunt corelate, celulele viabile, apoptotice în stadii timpurii, intermediare și târzii pot fi clasificate și analizate (figura 4).

Concluzie – Moartea celulară: Discriminarea între apoptoză, necroză & autofagie

Moartea celulară este un proces natural esențial pentru multe funcții fiziologice normale atât pentru dezvoltare, cât și pentru homeostazie. În plus, alterările din cadrul căilor de semnalizare a morții celulare sunt asociate cu diverse boli. Măsurarea semnelor individuale ale celulelor muribunde nu este suficientă pentru a discrimina între diferitele căi de moarte celulară, care includ apoptoza, necroza și autofagia; în schimb, este necesară o evaluare multiparametrică care să includă atât criterii descriptive, cât și funcționale.

Dezvoltarea recentă a tehnologiei permite acum o cunoaștere mai profundă a markerilor moleculari și a modificărilor celulare care caracterizează fiecare cale de moarte celulară și, de asemenea, a făcut posibilă efectuarea multora dintre aceste analize ca experimente de rutină pe bancă. DDW

–

Acest articol a apărut inițial în ediția de iarnă 2014 a DDW

–

Dr. John Abrams este profesor de biologie celulară; cercetările sale examinează rețelele moleculare in vivo implicate în reglarea morții celulare și explorează factorii determinanți ai organizării cromatinei. S-a alăturat University of Texas Southwestern Medical Center în 1994 și a devenit președinte de program al programului pentru absolvenți de genetică și dezvoltare în 2004. Dr. Abrams și-a finalizat doctoratul la Universitatea Stanford.

Dr. William G. Telford a devenit cercetător în cadrul Institutului Național de Cancer din cadrul National Institutes of Health în 1999 și este directorul laboratorului central de citometrie în flux din cadrul NCI Experimental Transplantation and Immunology Branch. A obținut un doctorat în microbiologie la Universitatea de Stat din Michigan și a urmat o pregătire postdoctorală în imunologie la Facultatea de Medicină a Universității din Michigan.

Louise Rollins este manager de produs la EMD Millipore Corporation, unde sprijină dezvoltarea analizorului celular Muse®, un citometru în flux miniaturizat, precum și a kiturilor de testare specifice aplicațiilor sale și a modulelor software pentru analiza de rutină a sănătății și morții celulare.

.