Abstract

Au fost determinate concentrațiile minime inhibitorii (MIC) și concentrațiile minime fungicide (MFC) pentru 38 de uleiuri de origine vegetală împotriva Candida albicans. În acest studiu au fost utilizate patru tulpini, inclusiv o tulpină standard. Agenții antifungici Fluconazol și Amfotericină B au fost utilizați ca martori pozitivi. Tulpina standard (ATCC10231) utilizată în acest studiu s-a dovedit a fi foarte rezistentă la Fluconazol: A fost nevoie de 3000 μg ml-1 de Fluconazol pentru a inhiba parțial creșterea acestei tulpini, iar inhibarea completă nu a putut fi obținută. Alte tulpini de Candida au fost sensibile la 5 μg ml-1 de Fluconazol. Toate tulpinile utilizate au fost sensibile la amfotericina B. Dintre cele 38 de uleiuri testate, 23 au fost considerate eficiente și 15 au fost ineficiente. Pe baza MFC-urilor lor, uleiurile eficiente au fost clasificate în trei categorii. Șapte uleiuri, care au exercitat un efect fungicid la o concentrație de uleiuri mai mică de 0,15 %, au fost grupate în clasa cea mai eficientă. Uleiurile care prezentau MFC în intervalul de concentrație de 0,16-1,5% au fost considerate moderat eficiente. Nouă uleiuri, care au necesitat o concentrație mai mare de 1,5%, au fost considerate ca fiind mai puțin eficiente. Tulpina rezistentă la fluconazol (MTCC 227) a fost sensibilă la cel puțin 23 dintre uleiurile vegetale. Rezultatele acestui studiu indică faptul că uleiurile de origine vegetală își pot găsi utilizarea ca potențiali agenți anti-Candida.

1 Introducere

Amfotericn B și Fluconazolul sunt doi agenți importanți utilizați în chimioterapia antifungică împotriva ciupercilor patogene umane . Amfotericina B este utilizată ca medicament de elecție la pacienții în fază terminală . Medicamentul azole, Fluconazol este prescris pe scară largă împotriva diferitelor infecții cu Candida albicans . Chiar dacă sunt aclamate pe scară largă pentru eficacitatea lor, se știe că aceste medicamente au efecte secundare . Fluconazolul este de natură fungistatică și există rapoarte de apariție a rezistenței la Fluconazol în rândul izolatelor clinice de C. albicans. Astfel, este nevoie de agenți antifungici noi și mai buni împotriva infecțiilor cauzate de C. albicans, care să fie eficienți și să aibă mai puține efecte secundare.

Mulți agenți naturali, cum ar fi produsele vegetale, inclusiv extractele, uleiurile etc., sunt utilizați în mod tradițional împotriva diferitelor afecțiuni . Unele dintre produsele vegetale sunt eficiente împotriva infecțiilor fungice și bacteriene . Uleiurile esențiale, cum ar fi uleiul de arbore de ceai, uleiul de lămâie, uleiul de citronella, uleiul de palmarosha și unii dintre constituenții lor au fost testați împotriva creșterii in vitro a C. albicans.

Am testat eficacitatea in vitro a 38 de uleiuri vegetale împotriva a patru izolate de C. albicans. Sunt raportate concentrațiile minime inhibitorii (MIC) și concentrațiile minime fungicide (MFC) ale uleiurilor eficiente. Pe baza eficacității lor (MFC), uleiurile sunt clasificate în trei categorii.

2 Materiale și metode

2.1 Substanțe chimice și tulpini

În acest studiu au fost utilizate o tulpină standard, tulpina tip ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), o tulpină de referință sugerată pentru testul cu amfotericină B, și trei izolate clinice de C. albicans. Cele trei izolate clinice de C. albicans, și anume SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II), SRTCC III (CA III), au fost obținute de la SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). India. Tulpina standard a fost achiziționată de la The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, India.

În acest studiu au fost utilizate 38 de uleiuri vegetale. Unele dintre uleiuri au fost furnizate cu amabilitate de către Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, India, iar uleiurile rămase și medicamentele antifungice, Amfotericina B și Fluconazol au fost achiziționate de pe piața locală.

2.2 Pregătirea inoculului

Toate tulpinile de C. albicans utilizate în acest studiu au fost cultivate la 30 °C timp de 24 de ore într-un incubator cu agitare, folosind mediul Yeast Extract Peptone și mediul Sabouraud Dextrose. Celulele au fost recoltate prin centrifugare, suspendate în apă distilată sterilă și utilizate imediat. Numărul de celule a fost determinat cu ajutorul unui hemocitometru și ajustat la 5 × 106 ufc ml-1.

2.3 Screening of plant oils for anti-Candida activity by disc diffusion assay

Activitatea anti-Candida a 38 de uleiuri vegetale a fost testată prin testul standard de difuzie pe disc. Plăcile de Sabouraud Dextrose Agar au fost pregătite și însămânțate cu 5 × 106 ufc ml-1 folosind inoculii de tulpini de Candida preparate ca mai sus. În mod aseptic, 5 μl de uleiuri vegetale au fost împrăștiate pe discuri de hârtie de filtru de 5 mm (Whatman nr. 1). Aceste discuri au fost apoi transferate în centrul plăcilor însămânțate. S-au folosit trei plăci pentru fiecare concentrație și s-au incubat la 30 ± 2 °C. Diametrul zonei de inhibiție a fost măsurat după 48 de ore de incubare.

2.4 Determinarea concentrației minime inhibitoare (CMI) a uleiurilor vegetale prin metoda diluției în agar

Centrările minime inhibitoare (CMI) ale uleiurilor vegetale au fost determinate prin testul de diluție în agar (23) Plăcile de agar au fost pregătite prin adăugarea de agar YPD care conținea diferite concentrații de uleiuri vegetale (adică 0,03-3% v/v). S-a adăugat Tween 20 0,5% (v/v) pentru a spori solubilitatea uleiului. Aceste plăci au fost inoculate cu 103 ufc, folosind inoculii de tulpini de Candida preparați ca mai sus. Plăcile au fost păstrate în triplicat pentru fiecare concentrație. Plăcile cu Tween 20, dar fără ulei vegetal, au fost utilizate ca martor. Toate aceste plăci au fost incubate la 30 ± 2 °C. Plăcile au fost observate și numărul de colonii a fost numărat după 48 de ore de incubare. Valorile CMI au fost determinate ca fiind cea mai mică concentrație de ulei care împiedică creșterea vizibilă a tulpinilor de Candida .

2.5 Determinarea concentrației minime fungicide (MFC) a uleiurilor vegetale prin metoda macrodiluției în bulion

Concentrația minimă fungicidă (MFC) a uleiurilor vegetale a fost determinată prin testul de macrodiluție în bulion (NCCLS M27-A, metoda de referință recomandată pentru testarea sensibilității antifungice a drojdiilor) . O gamă de concentrații (0,03-3% v/v) de ulei vegetal a fost preparată în mediu de bulion YPD în flacoane. Tween 80 a fost inclus la o concentrație finală de 0,001% (v/v) pentru a spori solubilitatea uleiului. Fiecare balon a fost inoculat cu 5 × 105 cfu ml-1 de tulpini de Candida. Baloții care conțineau Tween 20, dar nu conțineau niciun ulei vegetal, au fost utilizați ca martor. Baloanele au fost incubate la 30 ± 2 °C, într-un incubator cu agitare orbitală (100 rpm) timp de 48 de ore. 5 μl de cultură din fiecare balon au fost inoculate pe plăci YPD și incubate la 30 ± 2 °C timp de 48 de ore. Plăcile au fost observate, iar MFC au fost determinate ca fiind cea mai mică concentrație a uleiului vegetal care inhibă complet creșterea tulpinilor de Candida.

3 Rezultate

3.1 Screeningul uleiurilor vegetale pentru activitatea anti-Candida

Soluțiile izolate de C. albicans testate au prezentat sensibilitate diferită la uleiuri. Cu toate acestea, majoritatea uleiurilor au fost considerate eficiente și au prezentat o activitate considerabilă la concentrații foarte mici. Douăzeci și cinci dintre cele 38 de uleiuri testate au determinat o zonă de inhibiție (ZOI) de 1-30 mm. Șaptesprezece uleiuri au provocat o ZOI de 10-20 mm. Șase uleiuri au prezentat o ZOI de 1-9 mm împotriva tuturor celor patru tulpini testate. Uleiul de iasomie și de lavandă nu au reușit să inhibe creșterea tulpinilor de Candida, cu excepția CA IV. (tabelul 1). (13 uleiuri nu au reușit să inhibe creșterea tulpinilor de C. albicans la doze de 5 μl.)

3.2 Determinarea CMI ale uleiurilor vegetale împotriva C. albicans

CMI ale celor 23 de uleiuri eficiente și ale celor două medicamente prescrise pe scară largă, Fluconazol și Amfotericină B, au fost determinate împotriva celor patru izolate de C. albicans. Uleiurile au prezentat o inhibiție a creșterii dependentă de concentrație. În câteva cazuri, tulpinile testate au prezentat sensibilitate diferită, dar nu au existat diferențe considerabile în ceea ce privește CMI (tabelul 2).

Toate cele patru izolate s-au dovedit sensibile la amfotericina B. O concentrație de 2,5 μg ml-1 de amfotericină B a fost suficientă pentru a inhiba complet creșterea tulpinii CAI și a tulpinii CA IV (ATCC10231). Tulpinile CA II și CA III au necesitat 3 μg ml-1 de Amfotericină B pentru inhibarea totală a creșterii (tabelul 2).

Răspunsul la Fluconazol s-a dovedit a fi divergent. Tulpina Ca III a fost cea mai sensibilă și doar o concentrație de 2 μg ml-1 de Fluconazol a fost suficientă pentru inhibarea completă a creșterii. Tulpinile CA I și CA II au necesitat 5 μg ml-1 de Fluconazol () pentru inhibarea completă a creșterii (tabelul 2). Tulpina CA IV a fost foarte rezistentă la Fluconazol: Pentru o inhibiție parțială a creșterii a fost nevoie de 3 000 μg ml-1, adică de 1 500 ori mai mare decât CMI a tulpinii CA III. Inhibarea completă a creșterii nu a putut fi obținută la această tulpină nici măcar la o concentrație foarte mare.

O concentrație de 0,01% de ulei de scorțișoară a fost suficientă pentru a inhiba complet creșterea tuturor celor patru izolate. Uleiurile de iasomie și levănțică au provocat doar o ușoară inhibare a creșterii și nu au reușit să inhibe complet creșterea. Șapte uleiuri au inhibat complet creșterea tulpinilor de C. albicans, la un interval de concentrație de 0,03-0,15%. Pentru 11 uleiuri, MIC a variat de la 0,16% la 1,0% Cinci uleiuri au necesitat o concentrație mai mare de 1,0% (tabelele 2 și 3).

3.3 Determinarea MFC a uleiurilor vegetale împotriva C. albicans

Concentrația fungicidă minimă (MFC) este definită ca fiind cea mai mică concentrație de ulei care determină moartea a 99,9% din inoculum. Toate uleiurile care au inhibat creșterea au prezentat activitate fungicidă, cu excepția uleiurilor de iasomie și lavandă. În general, s-a observat că concentrația fungicidă a fost mai mare decât CMI, cu excepția câtorva cazuri, cum ar fi uleiurile de mentă, geraniu, ocimum, cuișoare și iarbă de ghimbir, care au provocat moartea a 99,9% din inocul la CMI. În funcție de MFC față de ATCC10231, uleiurile eficiente au putut fi clasificate în trei clase. Uleiurile care au provocat un efect fungicid la concentrația de 0,03-0,15% sunt considerate cele mai eficiente (ME). Uleiurile care necesită o concentrație de 0,15-1,0% sunt incluse în grupul moderat eficace (ME). Cele care au avut efect fungicid la o concentrație mai mare de 1,0% sunt considerate ca fiind mai puțin eficiente (LE).

Sapte uleiuri s-au dovedit a fi cele mai eficiente (ME) (tabelele 2 și 3). Uleiul de scorțișoară a fost cel mai bun, având efect fungicid la o concentrație de 0,03% în toate cele patru izolate de C. albicans. Uleiul de cuișoare a avut efect fungicid la concentrația de 0,12% și nu a existat nicio diferență între MIC și MFC. În cazul majorității uleiurilor ME, a fost necesară o concentrație de 2-4 ori mai mare decât CMI pentru efectul fungicid. Răspunsul izolatelor de Candida la unii membri ai acestui grup a fost divergent, adică al tulpinii CA II în cazul uleiului de mentă japoneză și al uleiului de iarbă de ghimbir, CA III în cazul uleiului de iarbă de lămâie și CA IV în cazul uleiului de iarbă de ghimbir (tabelul 2).

Uleiul de mentă și cel de arbore de ceai au fost cele mai bune din grupul celor șapte membri ME, determinând un efect fungicid la concentrația de 0,25% (tabelul 3). Uleiul de Tulsi a fost fungicid la concentrația de 0,5%, 1% a fost MFC al uleiurilor de Camfor, Lămâie, Ocimum și Ylang-ylang. S-a constatat, de asemenea, o diferență de sensibilitate pentru câțiva membri ai acestui grup. A fost necesară o CMI de două ori mai mare pentru aceste uleiuri, cu excepția uleiurilor de Mentă și Ocimum (tabelul 2).

Nouă uleiuri s-au dovedit a fi mai puțin eficiente (tabelul 3). Aceste uleiuri au necesitat mai mult de 1,0% pentru a exercita efectul fungicid. MFC a acestor uleiuri a variat de la 1,0% la 3%, cu excepția uleiurilor de iasomie, ghimbir și ienupăr, care nu au fost fungicide până la concentrația de 3%. CA II și CA III au prezentat o sensibilitate diferită (tabelele 2 și 3).

4 Discuție

Activitatea anti-candida a unora dintre uleiurile esențiale, cum ar fi uleiul de arbore de ceai, este bine cunoscută . Multe dintre preparatele utilizate împotriva candidozei vaginale cauzate de C. albicans conțin ulei de arbore de ceai ca și componentă activă . Mai multe uleiuri de origine vegetală au fost sugerate în medicina alternativă împotriva infecțiilor microbiene, inclusiv a candidozei și a gingivitei . Cu toate acestea, agenții antifungici azolici și derivații continuă să domine ca medicamente de elecție împotriva infecțiilor cu Candida, sub formă de aplicații topice sau ca medicamente orale . Cu excepția uleiului de arbore de ceai, care are o istorie de peste 80 de ani de utilizare în Australia, nu multe produse pe bază de plante au intrat pe piață . Unele produse care conțin ulei de rozmarin sunt utilizate împotriva ciupercilor care provoacă mătreața . A fost raportată activitatea anti-Candida in vitro a uleiurilor esențiale precum arborele de ceai, iarba de lămâie, citronela, menta și palmarosa . Am examinat eficacitatea a 38 de uleiuri de origine vegetală pentru activitatea anti-Candida in vitro împotriva a patru izolate de C. albicans (tabelele 1 și 2). Cel puțin 23 dintre uleiurile testate s-au dovedit promițătoare ca agenți eficace. Aceste uleiuri au putut fi clasificate în funcție de eficacitatea lor (tabelul 3). Unul dintre izolatele care s-a dovedit a fi rezistent la Fluconazol a fost inhibat la o concentrație foarte mică a tuturor uleiurilor eficiente de origine vegetală testate în acest studiu (tabelul 2).

Sondajul de difuzie a discului este o metodă standard utilizată pe scară largă pentru depistarea rapidă a produselor naturale pentru activitatea antifungică . Am testat uleiurile vegetale folosind această metodă de testare foarte convenabilă. Acest studiu indică faptul că este nevoie de prudență, deoarece diferite uleiuri pot avea viteze de difuzie diferite pe plăcile de agar și acest lucru poate contribui la variația zonelor de inhibiție, conducând la concluzii eronate cu privire la activitatea lor antifungică. De exemplu, unele dintre uleiurile care au prezentat zone de inhibiție mai mici în comparație cu altele au fost foarte eficiente împotriva tulpinilor de Candida în testul de diluție în bulion NCCLS, care nu implică difuzia. De exemplu, uleiul de scorțișoară a prezentat o ZOI de 24 mm în testul de difuzie pe disc, în timp ce uleiul de lemongrass a prezentat 30 mm. Dar în testul MFC, uleiul de scorțișoară (0,01%) s-a dovedit a fi mai bun decât uleiul de lemongrass (0,06%). Activitatea fungicidă este considerată ca fiind o calitate dezirabilă pentru agenții antifungici, deoarece ar putea elimina total ciuperca din țesuturi. Amfotericina B este fungicidă, este cunoscută ca fiind foarte eficientă împotriva ciupercilor patogene umane și este utilizată ca medicament de elecție în infecțiile fungice sistemice, în ciuda efectelor sale secundare severe . Fluconazolul, agentul antifungic prescris pe scară largă împotriva infecțiilor cu Candida, este de natură fungistatică și poate necesita o utilizare prelungită .

Este încurajator să observăm că majoritatea uleiurilor utilizate în acest studiu au fost fungicide la concentrații mici. Nu sunt disponibile prea multe informații cu privire la modul de acțiune al produselor naturale care inhibă creșterea Candida. În studiile viitoare trebuie incluse mai multe tulpini rezistente la Fluconazol/azol. Uleiurile de plante ar putea fi utilizate ca agenți anti-Candida împotriva tulpinilor rezistente la azole. Cele mai multe dintre uleiurile utilizate în acest studiu au un istoric îndelungat de utilizare în alimentație, cofetărie și ca și componente ale parfumurilor . Cu toate acestea, dacă acestea urmează să fie luate în considerare în preparatele topice, trebuie întreprinsă o explorare atentă a posibilelor lor efecte iritante și a altor efecte nedorite la om.

Recunoștințe

Autorii sunt recunoscători Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice-Cancelar, Universitatea SRTM, Nanded (MS) India, pentru încurajare.

(

)

.

,

–

.

(

)

.

,

–

.

>

(

)

.

,

–

.