Testarea concentrației minime inhibitoare (MIC) și a concentrației minime bactericide (MBC) definește potența unui material de testare în termeni de concentrație la care acesta va inhiba creșterea (concentrația minimă inhibitoare, sau MIC) sau omoară complet (Concentrația minimă bactericidă sau MBC) 1 x 106 (un milion) de microorganisme de probă în timpul unei perioade de 18-20 de ore de expunere la incubator (35 ± 2°C).
Metoda CMI măsoară efectul unor concentrații descrescătoare de antiseptic pe o perioadă de timp definită în ceea ce privește inhibarea creșterii populației microbiene. Concentrația de medicament necesară pentru a produce efectul este definită drept concentrația minimă inhibitorie și este, în mod normal, de câteva sute până la mii de ori mai mică decât concentrația găsită în forma farmaceutică finită.
Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Referința standard utilizată ca bază pentru efectuarea determinării concentrației minime inhibitorii (CMI) este cea mai recentă versiune a Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (în prezent, CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) sau anaerobă (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & Prezentare generală a testului MBC
Produsul este diluat în serie 1:2 într-un mediu de creștere adecvat pentru a susține creșterea fiecărui microorganism de provocare, de obicei Mueller-Hinton Broth (MHB) sau Mueller-Hinton Agar (MHA), pentru a produce o serie de diluții de produs în mediu până la 1:32,768 (conform BSLI SOP L-2045). Cu toate acestea, în funcție de tipul de produs, este posibil ca seria de diluție să nu fie efectuată până acum. La tuburile din serie, fiecare dintre acestea conținând câte o parte aliquotă de 2,0 ml de produs diluat în serie în mediu de creștere, se adaugă acum 1,0 ml de o suspensie de 1 x 106 UFC/mL dintr-o specie de provocare. După 18 până la 24 de ore de expunere la incubare, se examinează tuburile care conțin suspensia de microorganism/produs/mediu de provocare pentru a determina cea mai mare diluție de produs (și, invers, cea mai mică concentrație de produs) care inhibă complet dezvoltarea microorganismului, determinată cu ochiul liber. Această valoare de diluție (și/sau valoarea concentrației produsului) se înregistrează ca valoare a concentrației minime inhibitoare.
În cazul în care se dorește determinarea MBC, se transferă cantități măsurate din suspensia de diluție care reprezintă concentrația minimă inhibitoare și din cele două sau trei suspensii de diluție care preced diluția concentrației minime inhibitoare, pe plăci cu mediu de creștere solid, care sunt apoi incubate timp de 24 de ore la 37E± 2E. După incubare, se examinează plăcile pentru a verifica dacă microorganismul de provocare se dezvoltă. Acea diluție de produs (și/sau concentrația de produs) care nu produce creșteri se înregistrează ca MBC. Rețineți că procedurile de testare MIC/MBC pot fi efectuate utilizând diluții în serie de 1:2 ale produsului în mediu de agar nutritiv (testare în fază solidă) sau utilizând diluții în serie de 1:2 ale produsului în mediu de bulion nutritiv (testare în fază de suspensie). Cu excepția cazului în care sponsorul solicită în mod specific metoda de diluție în agar, BSLI va efectua testarea MIC utilizând metoda de diluție în bulion macrotub, deoarece este mult mai puțin consumatoare de materiale și de timp.
Produse testate în cadrul unui medicament nou de investigație
Pentru produsele care trebuie testate în cadrul unui IND, FDA specifică în mod clar la pagina 31444 din TFM ce microorganisme trebuie utilizate pentru a provoca produsele in vitro. Pentru studiul privind concentrația minimă inhibitorie, TFM precizează că produsul finit, principiul activ al produsului și vehiculul produsului trebuie să fie provocate fiecare cu 25 de tulpini ATCC și 25 de tulpini proaspete izolate clinic din fiecare dintre cele 12 specii de bacterii Gram-negative și 11 specii de bacterii Gram-pozitive și cele două grupuri de specii de drojdii (Candida albicans și Candida spp., nu albicans). Prin urmare, acesta cuprinde un studiu foarte amplu care implică testarea a 1 250 de tulpini din totalul de 25 de bacterii și drojdii care sunt specificate în TFM față de fiecare dintre cele trei configurații de produse.
În ultimii ani, FDA a renunțat într-o oarecare măsură la această cerință oneroasă – deși produsul finit trebuie testat față de cele 1.250 de tulpini, așa cum s-a precizat, principiul activ al produsului și vehiculul produsului trebuie doar să fie confruntate cu cinci tulpini ATCC și cinci tulpini proaspete izolate clinic din fiecare dintre cele 25 de specii de bacterii/legiuni. Chiar și așa, acest lucru totalizează 250 de tulpini care trebuie testate atât pentru substanța activă, cât și pentru vehicul, iar studiul global TFM MIC este destul de masiv și costisitor – în total, 1 750 de determinări individuale ale concentrației minime inhibitoare. FDA permite, de asemenea, unele substituiri de specii (de exemplu, specii de Bacteroides, altele decât B. fragilis, și specii de Staphylococcus coagulazo-negativ, altele decât S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus și S. saprophyticus) pentru a se adapta la raritatea tulpinilor ATCC și/sau a izolatelor clinice ale unora dintre speciile cerute de TFM. Și, recunoscând că, în general, alcoolii nu sunt activi din punct de vedere antimicrobian după aproximativ două diluții 1:2, FDA nu solicită date privind CMI pentru produsele în care alcoolul este singurul component activ.
MIC & MBC Dovada conceptului în scopuri de marketing
Deși BSLI a efectuat mai multe dintre studiile complete privind concentrația minimă inhibitorie cerute de TFM pentru produsele înregistrate ca IND, majoritatea studiilor privind concentrația minimă inhibitorie și ocazional MBC sunt efectuate pentru dovada conceptului și în scopuri de marketing. În aceste tipuri de studii, BSLI recomandă, în general, clienților să testeze tulpini ATCC din toate cele 25 de specii/străini enumerate în TFM, plus un izolat clinic din fiecare (adică un total de 50 de tulpini de provocare).
.