Abstract
Am examinat efectele tratamentului cu sulfat de vanadiu (VOSO4) la 5 și 10 mg/kg timp de 30 de zile asupra activității pancreasului endocrin și a histologiei la șobolanii non-diabetici și la șobolanii diabetici induși de STZ. În grupul diabetic, nivelul de glucoză din sânge a crescut semnificativ, în timp ce nivelul insulinemiei a scăzut semnificativ. La sfârșitul tratamentului, VOSO4 în doză de 10 mg/Kg a normalizat nivelul glucozei din sânge în grupul diabetic, a restabilit insulinemia și a îmbunătățit semnificativ sensibilitatea la insulină. VOSO4 a crescut, de asemenea, într-o manieră dependentă de doză, numărul de celule beta imunopozitive pentru insulină în insulele pancreatice ale șobolanilor non-diabetici. Mai mult, în grupul STZ-diabetic, scăderea numărului de celule beta imunopozitive la insulină a fost corectată pentru a ajunge la nivelul de control în principal cu doza mai mare de vanadiu. Prin urmare, tratamentul cu VOSO4 a normalizat nivelurile plasmatice de glucoză și insulină și a îmbunătățit sensibilitatea la insulină în diabetul experimental STZ și a indus proliferarea și/sau regenerarea celulelor beta la șobolanii normali sau diabetici.
1. Introducere
Vanadiul este un metal de tranziție. Se estimează că peste 60 de mii de tone din acest element sunt emise în atmosferă în fiecare an ca urmare a activităților umane, în principal din arderea combustibililor fosili .
După ce intră în sistemul circulator prin tractul gastrointestinal sau respirator, compușii de vanadiu sunt transportați de transferrină sau, mai rar, de albumină sau de componentele cu moleculă mică ale plasmei, cum ar fi citrații și, într-o măsură mai mică, lactații sau fosfații . S-au efectuat numeroase studii asupra derivaților anorganici și organici de vanadiu în modele animale de diabet indus, în care s-a constatat că compușii studiați au un impact asupra nivelurilor de glucoză, colesterol și trigliceride, fără efecte secundare nocive semnificative în cazul administrării prelungite . Multe experimente au fost, de asemenea, efectuate la pacienții diabetici, confirmând efectul terapeutic al compușilor de vanadiu asupra nivelului de glucoză din sânge, cu puține efecte toxice .
S-a demonstrat că vanadiul (inclusiv vanadilul și vanadatul) reduce nivelul de glucoză din sânge prin stimularea glicogenezei, a absorbției și metabolismului glucozei și prin inhibarea formării de glucoză prin gluconeogeneză hepatică și glicogenoliză . S-a constatat că vanadiul și compușii de vanadiu prezintă o activitate asemănătoare insulinei prin imitarea acțiunilor insulinei prin intermediul căilor de activare a tirozin kinazei receptorului de insulină și a cascadei de fosforilare a kinazei . Prin urmare, sulfatul de vanadil a fost sugerat ca agent terapeutic pentru tratamentul diabetului de tip 1 . Tratamentul cu streptozotocină (STZ) distruge celulele beta producătoare de insulină din pancreas, iar șobolanii diabetici induși de STZ sunt considerați un model de diabet zaharat de tip 1 . Deși s-a demonstrat că compușii de vanadiu au proprietăți antidiabetice în modelul de diabet indus de STZ, mecanismul de acțiune al acestora a rămas în prezent în curs de investigare. Scopul acestui studiu a fost acela de a investiga răspunsurile unui tratament de 30 de zile cu sulfat de vanadiu la șobolanii non-diabetici și la șobolanii diabetici induși de STZ.
2. Materiale și metode
2.1. Pregătirea șobolanilor diabetici
Animalele au fost făcute diabetice printr-o injecție intraperitoneală (ip) de STZ într-o doză unică de 65 mg/Kg în tampon citrat 0,01 M (pH 4,5). Această metodă ip a fost aleasă pe baza unor rapoarte recente care au demonstrat un efect pronunțat de creștere a glucozei la șobolanii STZ-diabetici .
2.2. Animale și tratament
Șobolani Wistar masculi, în vârstă de 5-6 săptămâni (greutate 175-200 g), au fost achiziționați de la Institutul Pasteur din Tunisia și utilizați în conformitate cu Comitetul local de etică al Universității din Tunis pentru utilizarea și îngrijirea animalelor în conformitate cu recomandările NIH. Aceștia au primit hrană (dietă standard de pelete-Badr Utique-TN) și apă ad libitum și au fost adăpostiți câte cinci pe cușcă la o temperatură colectată (22°C) cu un ciclu lumină-întuneric de 12 ore. Șobolanii au fost împărțiți în șase grupuri.
Grupul 1 a fost reprezentat de animale de control non-diabetice (control ND) și a primit zilnic o injecție intraperitoneală (ip) de NaCl 9. Grupurile 2 și 3 au fost ND și au primit zilnic o doză de 5 sau 10 mg de VOSO4/Kg, respectiv (ND + 5 mg/Kg și ND + 10 mg/Kg), timp de 30 de zile. Grupul 4 a fost un martor diabetic (martor D) căruia i s-a injectat o singură doză de 65 mg/Kg de STZ. Grupurile 5 și 6 au cuprins animale diabetice STZ tratate cu 5 sau 10 mg/Kg de VOSO4 timp de 30 de zile, respectiv (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Grupurile STZ au fost tratate cu VOSO4 după 48 de ore de diabet indus de STZ.
2.3. Teste biochimice
Toate animalele au fost ținute la post 12 ore înainte de determinarea glicemiei cu ajutorul unui glucometru (ACCU-CHEK-Active Roche). Sensibilitatea la insulină a fost măsurată după injectarea ip a 1 U/Kg de insulină și nivelurile de glucoză din sânge au fost determinate la intervale de 30 de minute pe parcursul a 2 ore ca procent din nivelul hormonului la .
Animalele au fost sacrificate după 24 de ore de la ultimul tratament, iar sângele a fost colectat și serul a fost procesat pentru estimarea insulinei care a fost determinată prin kitul Elisa (distribuit de BioVendor).
2.4. Evaluarea imunohistochimică
S-a efectuat o colorare imunohistochimică a insulinei pentru a caracteriza integritatea celulelor beta din insulele Langerhans. Pentru aceasta, au fost selectate secțiuni de țesut care prezintă suprafața maximă mai mare a insulelor Langerhans pentru comparații între grupuri. Secțiunile au fost mai întâi deparafinate, hidratate printr-o serie de etanol gradual descrescător, imersate în tampon citrat (pH 6) timp de 40 de minute și apoi incubate cu un anticorp policlonal de cobai anti-insulină diluat în 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). După spălare, secțiunile au fost incubate cu anticorpul anti-Guineea conjugat cu fosfatază, iar procedura de revelare a fost asistată de aparatul TechMate 500. În cele din urmă, secțiunile au fost colorate cu hematoxilină/eozină.
Două insulițe pancreatice per șobolan au fost examinate la microscop și numărul de celule insulino-pozitive și insulino-negative a fost numărat prin numerotarea nucleilor acestora. Datele sunt exprimate ca procent de celule imunopozitive pentru insulină/numărul total de celule din fiecare insuliță.
2.5. Analiză statistică
Semnificația diferenței dintre diferitele grupuri a fost evaluată prin analiza varianței (ANOVA) cu o singură cale, urmată de testul de comparație multiplă Tukey, iar valoarea a fost considerată semnificativă la nivel.
3. Rezultate
Efectul tratamentului cu VOSO4 asupra nivelului de glucoză din sânge la șobolanii non-diabetici (ND) și diabetici (D) este prezentat în figura 1. Nu au existat modificări semnificative ale nivelurilor de glucoză din sânge în grupul ND de control în timpul tratamentului [figura 1(a)]. Tratamentul șobolanilor ND cu VOSO4 la 5 sau 10 mg/Kg nu a modificat semnificativ nivelul glicemiei în primele 10 zile. Cu toate acestea, nivelul glicemiei a scăzut semnificativ la sfârșitul tratamentului cu doza de 5 mg/Kg și a fost redus semnificativ între 15 și 30 de zile cu doza de 10 mg/Kg în comparație cu grupul ND de control. În ziua 30, scăderea glicemiei a fost de aproximativ 8 și, respectiv, 15%, pentru dozele de 5 și 10 mg/Kg, comparativ cu grupul de control. După cum se bănuia, s-a observat o creștere notabilă a nivelului de glucoză din sânge la șobolanii de control tratați cu STZ în comparație cu animalele netratate ( versus mg/dL), ceea ce indică instalarea diabetului care s-a menținut pe parcursul întregului experiment. Tratamentul grupului diabetic (D) cu 5 mg/Kg de VOSO4 a redus semnificativ nivelul glicemiei din ziua 10, în timp ce o doză de 10 mg/Kg a scăzut semnificativ și treptat nivelul glicemiei din ziua 5 pentru a ajunge la un nivel normal în ziua 30. Valorile observate ale glicemiei la 30 de zile au fost și față de mg/dL, respectiv, în grupurile D + 5, D + 10 și grupul D de control (figura 1(b)).
Tabelul 1 a arătat nivelurile de insulină în grupurile ND și D fără și după tratamentul cu VOSO4. Șobolanii ND tratați cu 5 mg/Kg de VOSO4 nu au prezentat modificări semnificative ale nivelului de insulinemie, dar o creștere marcantă a fost obținută cu 10 mg/Kg în comparație cu grupul ND de control ( versus µg/L). Mai mult, în grupul D de control, insulinemia a fost profund diminuată în comparație cu animalele ND de control ( versus µg/L). Administrarea de VOSO4 în grupurile D a crescut marcat insulinemia într-o manieră dependentă de doză. De fapt, nivelurile de insulină au crescut la șobolanii diabetici de la până la și µg/L cu doze de 5 mg și, respectiv, 10 mg/Kg.
Modificările sensibilității la insulină în urma injecției ip de insulină (1 U/Kg) la animalele normale și la cele tratate cu diabet sunt prezentate în figura 2. La șobolanii ND, tratamentul cu 10 sau 5 mg de VOSO4 nu a modificat profilul glicemiei ca răspuns la administrarea de insulină [figura 2(a)]. Într-adevăr, în aceste grupuri, efectul hipoglicemiant maxim al insulinei a fost observat la 60 și, respectiv, 90 de minute, și a fost aproximativ de valoarea glicemiei inițiale. Animalele diabetice tratate cu doza mică de VOSO4 au prezentat un profil de glicemie similar cu cel al grupului de control D, cu o scădere maximă până la 60 min, în timp ce cele tratate cu doza mare au prezentat o scădere maximă semnificativă () și rapidă a glicemiei până la 30 min după injectarea de insulină (Figura 2(b)).
În grupurile de tratament cu VOSO4, s-a observat că dimensiunea insulelor pancreatice a fost mai mare în comparație cu grupurile de control ND și D respective (Figurile 3 și 4). Analizele statistice au arătat că tratamentele cu VOSO4 au indus o creștere marcantă a numărului de celule imunopozitive pentru insulină cu aproximativ 20% în grupurile ND + 5 și 27% în grupurile ND + 10 mg/Kg (figura 5). Tratamentul cu VOSO4 a crescut semnificativ numărul de celule imunopozitive pentru insulină în grupurile STZ-diabetice într-o manieră dependentă de doză, cu 12 și, respectiv, 23%, cu doze de 5 și 10 mg/Kg (Figura 5). Comparația dintre grupurile tratate cu STZ-diabetici și șobolanii de control ND nu a indicat diferențe semnificative.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Colorarea imunohistochimică a insulinei în celulele beta din insulele pancreatice Langerhans de la STZ-șobolani diabetici. Observați că există mai multe celule imunopozitive pentru insulină la șobolanii STZ-diabetici tratați decât la șobolanii STZ-diabetici netratați. Control D (a), D tratat cu 5 mg/Kg de VOSO4 (b) și D tratat cu 10 mg/Kg de VOSO4 (c). Au fost analizate zece insulițe per șobolan. Bară de scară: 50 µm.
Efectul sulfatului de vanadil asupra numărului de celule beta în %. Valorile reprezintă media ± SD. ; față de martorul ND. ; față de martorul D. față de D + 5 mg/Kg. Au fost analizate 10 insulițe per șobolan.
4. Discuții
Am studiat proprietățile antidiabetice ale vanadiului prin explorarea efectelor sale asupra glicemiei și a nivelului de insulină, precum și asupra celulelor B ale pancreasului endocrin.
Utilizând șobolani diabetici induși de STZ, am arătat că tratamentul cu sulfat de vanadil (VOSO4) la 5 și 10 mg/Kg a redus semnificativ nivelul mediu al glicemiei în ziua a 10-a și, respectiv, a 5-a, în comparație cu grupul de control netratat. În ziua 30, șobolanii diabetici cărora li s-a administrat doza mai mare de compus au prezentat un nivel de glicemie similar cu cel al animalelor de control ND. Cu toate acestea, la șobolanii ND, tratamentul cu doza mai mică de VOSO4 nu a modificat semnificativ nivelul glicemiei, în timp ce doza mai mare a indus o scădere mică și treptată până în ziua 15 de tratament, iar glicemia a scăzut cu aproximativ 14% în ziua 30. Rezultatele noastre sunt în concordanță cu datele anterioare care demonstrează că administrarea orală a compușilor de vanadiu la animalele diabetice induse de STZ sau moștenite genetic sau nutrițional a ameliorat semnificativ hiperglicemia . La om, Soveid și colab. au raportat siguranța și eficacitatea tratamentului oral cu sulfat de vanadil pe o perioadă de 30 de luni la pacienții diabetici de tip 1, prin scăderea necesarului de insulină și a nivelului de glucoză din sânge.
Studiul nostru a arătat, de asemenea, că efectul hipoglicemiant al VOSO4 a fost însoțit de o creștere marcantă a nivelului insulinemiei bazale în grupul diabetic, într-o manieră dependentă de doză. Cu doza de 10 mg, nivelul de insulinemie al șobolanilor diabetici a fost aproape normalizat. Într-adevăr, scăderea nivelului de glucoză din sânge înregistrată în special la șobolanii diabetici expuși la compusul de vanadiu poate fi legată de creșterea concomitentă a concentrațiilor plasmatice de insulină. Aceste rezultate au fost în concordanță cu datele anterioare privind eficacitatea compușilor de vanadiu în ameliorarea stării diabetice .
În continuare, am investigat efectul administrării de vanadiu asupra sensibilității la insulină la șobolanii diabetici și non-diabetici. La grupurile ND, am evidențiat un efect hipoglicemiant maxim al insulinei la 60-90 min după introducerea hormonului. Cu toate acestea, la grupurile D, tratamentul cu VOSO4 cu o doză de 10 mg a îmbunătățit sensibilitatea la insulină cu o scădere mai rapidă și mai pronunțată a glicemiei după injectarea hormonului, în timp ce doza de 5 mg nu a modificat semnificativ răspunsul glicemic al șobolanilor D. Îmbunătățirea sensibilității la insulină indusă de VOSO4 este în concordanță cu numeroasele studii care indică faptul că vanadiul poate fi considerat un puternic mimetic al insulinei sau un trofic al insulinei în diferite țesuturi .
S-a demonstrat că compușii de vanadiu se caracterizează prin multiple căi de acțiune care au ca rezultat scăderea glicemiei . Studiile in vivo și in vitro au raportat că sulfatul de vanadil a crescut transportul și metabolismul glucozei în mușchii scheletici, ficat și țesuturile adipoase . Datorită similitudinii lor structurale cu anionii ortofosfat, derivații organici de vanadiu inhibă proteina fosfotirozină fosfatază . Aceștia inhibă, de asemenea, activitatea PTP-1B, enzima responsabilă de defosforilarea receptorului de insulină, provocând rezistența la insulină . Un alt mecanism de reducere a nivelului de glucoză din sânge de către compușii de vanadiu este activarea kinazei PKB/Akt, ceea ce duce la creșterea absorbției de glucoză de către transportorul GLUT4 . Activarea PKB/Akt stimulează, de asemenea, fosforilarea GSK3, ceea ce duce la stimularea sintezei de glicogen . Pe de altă parte, s-a constatat că inhibarea C-jun N-terminal kinazei îmbunătățește sensibilitatea la insulină în diabetul experimental .
Vanadiul crește transportul și oxidarea glucozei și activitatea tirozin-kinazei receptorilor de insulină și exercită efecte asemănătoare insulinei asupra metabolismului glucozei și lipidelor prin căi biochimice insulino-dependente sau insulino-independente .
Este bine cunoscut faptul că tratamentul cu STZ distruge celulele beta din insulele pancreatice inducând diabetul zaharat insulino-dependent . Astfel, în studiul de față, am arătat o reducere a suprafeței insulelor pancreatice asociată cu o scădere accentuată a numărului de celule beta imunoreactive pentru insulină în grupul diabetic în comparație cu animalele martor non-diabetice. Cu toate acestea, în ambele grupuri ND și D, tratamentul cu VOSO4 a mărit dimensiunea insulelor pancreatice în comparație cu grupurile de control respective. Cel mai important, tratamentul cu VOSO4 al șobolanilor diabetici a crescut în mod dependent de doză numărul de celule beta imunopozitive pentru insulină, spre deosebire de grupul diabetic netratat, sugerând că VOSO4 poate genera celule beta la șobolanii diabetici induși de STZ. De fapt, numărul de celule beta din insulele de la șobolanii diabetici tratați cu VOSO4 cu 5 și 10 mg nu a fost semnificativ diferit de cel al grupului ND. Acest lucru este în concordanță cu investigațiile anterioare privind proprietatea insulinotropică pancreatică a acestui compus . Interesant este faptul că tratamentul cu vanadiu a crescut semnificativ și numărul de celule beta în insulele șobolanilor nediabetici.
Într-un model de șoarece de pancreas cu segment aloxan-perfuzat, Waguri și colab. au raportat procese de regenerare a celulelor beta din celule precursoare extraisletine. Într-adevăr, la șobolanii STZ-diabetici, tratamentul cu VOSO4 ar putea stimula proliferarea celulelor beta din celulele endocrine intraisletine și diferențierea din celulele precursoare extraisletine.
În concluzie, studiul de față demonstrează că sulfatul de vanadil ar putea fi util ca potențial agent antidiabetic. Cu toate acestea, deoarece dovezile actuale sunt încă limitate și se bazează în principal pe modele animale și se cunosc puține lucruri despre formulările terapeutice și efectele secundare ale compușilor de vanadiu, sunt necesare investigații suplimentare privind utilizarea lor pe termen lung ca terapie convențională pentru pacienții diabetici.
Conflict de interese
Autorii declară că nu există niciun conflict de interese în ceea ce privește publicarea acestei lucrări.
Recunoaștere
Această lucrare a fost susținută de Ministerul Tunisian al Învățământului Superior și al Cercetării Științifice.
.