Un inhibidor no competitivo es un inhibidor que sólo se une al complejo enzima-sustrato. La formación de su sitio de unión sólo se forma cuando la enzima y el sustrato han interactuado entre sí. La inhibición no competitiva no funciona cuando se trata de sustratos adicionales. El complejo enzima-sustrato-inhibidor no produce ningún producto
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-> E + P
El inhibidor no competitivo se une al complejo enzima-sustrato para impedir que la enzima reaccione con el sustrato para formar el producto, como tal, funciona bien en concentraciones más altas de sustrato y enzima que los sustratos se unen a las enzimas; la unión da lugar a la disminución de la concentración de unión del sustrato a la enzima, la Km y la Vmax, y al aumento de la afinidad de unión de la enzima al sustrato.
E + I -> (a través de S) ES + I -> E + P
donde E es la enzima, I es el inhibidor, ES es el complejo enzima-sustrato y P es el producto.
Esta unión del sustrato modifica la estructura de la enzima haciendo que el sitio de unión del inhibidor esté disponible. La inhibición no competitiva disminuye la velocidad máxima así como la KM. K,M es la concentración del sustrato cuando la velocidad es la mitad de la velocidad máxima según el modelo cinético de Michaelis-Menten. Tanto la Vmax como la KM se reducen en cantidades iguales. La Vmáx seguirá reduciéndose aunque la unión de la enzima con el sustrato aumente porque se están formando complejos ESI. Los complejos ESI inhiben la formación del producto. Un inhibidor no competitivo reducirá la KM y creará una mejor unión enzima-sustrato porque sólo se une al complejo ES. Pero el complejo ES se agota constantemente a medida que el inhibidor se une, produciendo complejos ESI. Por lo tanto, para mantener el equilibrio entre los complejos ES y ESI y siguiendo el Principio de Le Chatelier, la reacción se desplaza hacia la formación de más ES donde se unirá más sustrato a las enzimas para crear más ES. En última instancia, esto conduce a un KM más bajo. Una KM reducida indica una mejor unión enzima-sustrato porque la enzima puede alcanzar la mitad de su velocidad máxima con menos concentración de sustrato. En cierto sentido, la unión enzima-sustrato es muy eficiente porque la enzima y el sustrato tienen una gran afinidad e interactúan fuertemente.