Profundidad de campo

La consecuencia de la apertura numérica es que se relaciona directamente con la profundidad de campo (DOF). Para un objetivo dado, mirando una muestra, hay un plano particular de enfoque perfecto. La profundidad de campo es, cuán por encima y por debajo de ese plano pueden estar el objetivo y la muestra y seguir teniendo todo enfocado.

Lo mismo ocurre en la fotografía tradicional, una apertura muy pequeña aumentará la profundidad de campo. Una mayor apertura numérica dará una mayor resolución, pero la profundidad de campo se reduce considerablemente. Hay una distancia por encima del plano de la muestra y una distancia por debajo del plano de la muestra, y en cualquier lugar dentro de ellas, hay un enfoque esencialmente perfecto. En cuanto el objetivo y la muestra están fuera de ese límite, la imagen empieza a ser borrosa.

Esto se llama profundidad de campo. La fórmula de la profundidad de campo es:

donde:
«n» es el índice de refracción del material entre el objetivo y la muestra
λ (lambda) es la longitud de onda de la luz
NA es la apertura numérica

En la mayoría de los casos el material entre el objetivo y la muestra es aire, y «n» es igual a 1,00. Para el agua, su índice de refracción es 1,33, y el aceite de inmersión especializado para microscopía es 1,52. Para un objetivo de bajo aumento, como un 4X o incluso un 10X, la profundidad de campo típica es de más o menos 3 a 5 micras. En ese caso, si la muestra es muy plana, puede que no sea necesario enfocar en absoluto, o que sólo haya que hacerlo una vez. En general, las muestras varían en grosor y varían en planitud, por lo que es necesario enfocar.

Para un aumento de 20X, que puede ser una apertura numérica de 0,6 a 0,8, la profundidad de campo desciende a unos 500 nanómetros más o menos. Al pasar a un gran aumento con inmersión en aceite a una apertura numérica de 1,47, la profundidad de campo desciende de forma drástica, y la profundidad de campo podría ser de más o menos 0,1 a 0,2 micras (100 – 200 nm). Es una tolerancia muy ajustada. A 100 nanómetros o 200 nanómetros, cambios muy pequeños en la planitud de la muestra o en la altura de la muestra, o la precisión de las guías de la etapa de movimiento de la muestra XY, harán que sea difícil mantener el enfoque. Para mantener el enfoque en esta situación, un sistema de autoenfoque láser de seguimiento continuo conectado a una etapa de enfoque de objetivos de gran ancho de banda, como el DOF-5, es la forma ideal de mantener el enfoque en estas aplicaciones de alta apertura numérica y alta resolución.