Propiedades y detección de la neurotoxina botulínica
Los clostridios producen más tipos de toxinas proteicas que cualquier otro género de microorganismos. La característica más destacada del Clostridium botulinum es su capacidad para sintetizar una neurotoxina de extraordinaria potencia. Las BoNT comprenden una familia de toxinas farmacológicamente similares que se unen a las sinapsis colinérgicas periféricas y bloquean la exocitosis de acetilcolina en las uniones neuromusculares. Las BoNT se producen en los alimentos, en el intestino y en los cultivos como complejos de toxinas progenitoras que consisten en neurotoxina botulínica asociada a proteínas no tóxicas. Se ha demostrado que los componentes no tóxicos de los complejos confieren estabilidad a la neurotoxina y evitan la inactivación por parte de las enzimas digestivas en el intestino.
El diagnóstico del botulismo se realiza generalmente mediante la evaluación de los síntomas clínicos en los pacientes, y en el caso de los brotes de origen alimentario, en la agrupación de casos que implican a un grupo de personas que han consumido un alimento común. En la mayoría de las investigaciones sobre botulismo, el objetivo principal es detectar la presencia de BoNT, ya que las esporas de C. botulinum están muy extendidas en el medio ambiente y contaminan muchos alimentos. La detección de BoNT en la sangre, el contenido gástrico y los alimentos proporciona la confirmación del botulismo. El aislamiento de C. botulinum a partir de un alimento sospechoso, de las heces de bebés con síntomas de botulismo o de las heridas proporciona pruebas de apoyo al diagnóstico de botulismo. Sin embargo, no proporciona una confirmación en la mayoría de los casos, ya que las esporas se encuentran en los alimentos y, ocasionalmente, en las heces de adultos sanos.
El BoNT se detecta preferentemente mediante un bioensayo de la toxina extraída de un alimento o una muestra clínica. El extracto se inyecta por vía intraperitoneal en ratones y los animales se observan periódicamente para detectar los signos típicos del botulismo durante un máximo de cuatro días. Dependiendo de la cantidad de BoNT presente, los síntomas de botulismo se observan generalmente en un plazo de 4 a 24 horas. Los síntomas característicos incluyen la disminución de la movilidad de los animales, el erizamiento del pelaje, la dificultad para respirar, la contracción de los músculos abdominales dando la morfología de «avispa», seguida de convulsiones y la muerte. Los animales que muestran estos signos suelen morir en un plazo de 24-48 h. Los animales que mueren antes de 2 h o después de 48 h deben considerarse como sucumbidos a sustancias distintas del BoNT. La muerte debida a la BoNT se confirma mediante la neutralización con antitoxinas específicas del serotipo.
A menudo se encuentran complicaciones en el bioensayo con ratones de la BoNT a partir de muestras clínicas y de ciertos alimentos. En particular, son comunes las muertes causadas por sustancias que no interfieren con el BoNT. Estas muertes inespecíficas pueden evitarse generalmente diluyendo la sustancia letal interferente hasta un punto final en el que la muerte es causada por el BoNT más potente. Ocasionalmente, puede haber más de un serotipo de BoNT en una muestra que se esté analizando, y la confirmación requeriría la neutralización mediante una mezcla de antitoxinas. En el caso de los alimentos o de las muestras clínicas, pueden producirse muertes no botulínicas por infección o por la presencia de endotoxinas. Los agentes infecciosos pueden eliminarse mediante la filtración por membrana o la adición de antibióticos al extracto analizado. Los extractos que contienen endotoxinas generalmente pueden diluirse hasta un punto final adecuado, o las endotoxinas pueden eliminarse por adsorción. Con los extractos de cepas no proteolíticas de C. botulinum (grupo II), la toxicidad aumenta por la activación de una proteasa como la tripsina. En algunos alimentos, la tripsina puede generar péptidos tóxicos y, por lo tanto, la reacción debe terminarse mediante la adición de un inhibidor de tripsina de soja después de 30-60 minutos.
El C. botulinum viable puede aislarse de los alimentos mediante el enriquecimiento en un medio de crecimiento adecuado, como el caldo de carne cocida-glucosa o medios que contengan peptonas, extracto de levadura y glucosa. C. botulinum tiene requerimientos de nutrientes complejos y requiere un medio rico para su crecimiento. Para el aislamiento, suele ser útil calentar una porción del alimento o de la muestra clínica a 80° o 60°C para seleccionar las esporas de C. botulinum del grupo I y II, respectivamente. Ocasionalmente, se utiliza etanol al 50% para inactivar las células vegetativas en las muestras de alimentos analizadas para C. botulinum del grupo II. Tras el enriquecimiento, la presencia de BoNT se ensaya mediante un bioensayo en ratones como se ha descrito anteriormente. Se han utilizado agares de aislamiento selectivo que contienen antibióticos como cicloserina, sulfametoxazol y trimetoprima para el aislamiento de C. botulinum del grupo I a partir de muestras clínicas.
Se han desarrollado diversos métodos inmunológicos para la detección de BoNT, pero la mayoría no son tan sensibles como el bioensayo en ratones y también tienen el posible inconveniente de detectar BoNT biológicamente inactivo. Se han realizado varios avances en los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) para paliar estos inconvenientes y es probable que los ELISA se utilicen para complementar, pero no para sustituir, el bioensayo en ratones.