Resumen
Examinamos los efectos del tratamiento con sulfato de vanadio (VOSO4) a 5 y 10 mg/kg durante 30 días sobre la actividad del páncreas endocrino y la histología en ratas no diabéticas y diabéticas inducidas por STZ. En el grupo diabético, los niveles de glucosa en sangre aumentaron significativamente mientras que el nivel de insulinemia disminuyó notablemente. Al final del tratamiento, el VOSO4 en una dosis de 10 mg/Kg normalizó el nivel de glucosa en sangre en el grupo diabético, restauró la insulinemia y mejoró significativamente la sensibilidad a la insulina. El VOSO4 también aumentó de forma dependiente de la dosis el número de células beta inmunopositivas a la insulina en los islotes pancreáticos de las ratas no diabéticas. Además, en el grupo de diabéticos con STZ, la disminución del número de células beta inmunopositivas a la insulina se corrigió para alcanzar el nivel de control principalmente con la dosis más alta de vanadio. Por lo tanto, el tratamiento con VOSO4 normalizó los niveles de glucosa e insulina en plasma y mejoró la sensibilidad a la insulina en la diabetes experimental por STZ e indujo la proliferación y/o regeneración de las células beta en ratas normales o diabéticas.
1. Introducción
El vanadio es un metal de transición. Se estima que cada año se emiten más de 60 mil toneladas de este elemento a la atmósfera como resultado de las actividades humanas, principalmente por la combustión de combustibles fósiles .
Después de entrar en el sistema circulatorio a través del tracto gastrointestinal o respiratorio, los compuestos de vanadio son transportados por la transferrina o, con menor frecuencia, por la albúmina o por componentes de bajo peso molecular del plasma, como los citratos y, en menor medida, los lactatos o los fosfatos . Se han llevado a cabo numerosos estudios con derivados inorgánicos y orgánicos del vanadio en modelos animales de diabetes inducida, en los que se ha comprobado que los compuestos estudiados influyen en los niveles de glucosa, colesterol y triglicéridos, sin que se produzcan efectos secundarios perjudiciales significativos tras una administración prolongada . También se realizaron muchos experimentos en pacientes diabéticos, confirmando el efecto terapéutico de los compuestos de vanadio sobre los niveles de glucosa en sangre con escasos efectos tóxicos.
Se ha demostrado que el vanadio (incluidos el vanadilo y el vanadato) reduce el nivel de glucosa en sangre estimulando la glucogénesis, la captación de glucosa y el metabolismo e inhibiendo la formación de glucosa a través de la gluconeogénesis hepática y la glucogenolisis . Se ha descubierto que el vanadio y los compuestos de vanadio presentan una actividad similar a la de la insulina al imitar las acciones de la insulina a través de la activación de la tirosina quinasa receptora de la insulina y las vías de la cascada de fosforilación de la quinasa . Por lo tanto, el sulfato de vanadilo se ha sugerido como agente terapéutico para el tratamiento de la diabetes de tipo 1. El tratamiento con estreptozotocina (STZ) destruye las células beta productoras de insulina del páncreas y las ratas diabéticas inducidas por STZ se consideran un modelo de diabetes mellitus de tipo 1. Aunque se ha demostrado que los compuestos de vanadio tienen propiedades antidiabéticas en el modelo diabético inducido por STZ, el mecanismo de sus acciones sigue siendo objeto de investigación. El objetivo de este estudio fue investigar las respuestas de 30 días de tratamiento con sulfato de vanadio en ratas no diabéticas y diabéticas inducidas por STZ.
2. Materiales y métodos
2.1. Preparación de ratas diabéticas
Los animales se hicieron diabéticos mediante una inyección intraperitoneal (ip) de STZ en una dosis única de 65 mg/Kg en tampón citrato 0,01 M (pH 4,5). Este método ip se eligió basándose en informes recientes que demostraron un pronunciado efecto de aumento de la glucosa en ratas diabéticas con STZ.
2.2. Animales y tratamiento
Ratas Wistar macho, de 5-6 semanas de edad (con un peso de 175-200 g), se adquirieron en el Instituto Pasteur de Túnez y se utilizaron de acuerdo con el Comité Ético Local de la Universidad de Túnez para el uso y el cuidado de los animales de acuerdo con las recomendaciones de los NIH. Se les proporcionó comida (dieta estándar de pellets-Badr Utique-TN) y agua ad libitum y se alojaron cinco por jaula bajo temperatura recogida (22°C) con un ciclo de luz y oscuridad de 12 horas. Las ratas se dividieron en seis grupos.
El grupo 1 eran animales de control no diabéticos (control ND) y recibieron diariamente una inyección intraperitoneal (ip) de NaCl 9. Los grupos 2 y 3 eran ND y recibieron diariamente una dosis de 5 ó 10 mg de VOSO4/Kg, respectivamente (ND + 5 mg/Kg y ND + 10 mg/Kg), durante 30 días. El grupo 4 era un control diabético (control D) al que se le inyectó una dosis única de 65 mg/Kg de STZ. Los grupos 5 y 6 comprendían animales diabéticos de STZ tratados con 5 o 10 mg/Kg de VOSO4 durante 30 días, respectivamente (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Los grupos STZ fueron tratados con VOSO4 tras 48 horas de diabetes inducida por STZ.
2.3. Ensayos bioquímicos
Todos los animales fueron ayunados 12 horas antes de la determinación de la glucemia mediante un glucómetro (ACCU-CHEK-Active Roche). Se midió la sensibilidad a la insulina tras la inyección ip de 1 U/Kg de insulina y se determinaron los niveles de glucosa en sangre a intervalos de 30 min durante 2 horas como porcentaje del nivel de la hormona a.
Los animales fueron sacrificados después de 24 horas del último tratamiento y se recogió la sangre y se procesó el suero para la estimación de la insulina que se determinó mediante el kit Elisa (distribuido por BioVendor).
2.4. Evaluación inmunohistoquímica
Se realizó la tinción inmunohistoquímica de la insulina para caracterizar la integridad de las células beta en los islotes de Langerhans. Para ello, se seleccionaron secciones de tejido que mostraban la máxima superficie de los islotes de Langerhans para las comparaciones entre grupos. En primer lugar, las secciones se desparafinaron, se hidrataron mediante una serie gradual decreciente de etanol, se sumergieron en citrato de tampón (pH 6) durante 40 minutos y, a continuación, se incubaron con un anticuerpo policlonal anti-insulina de cobaya diluido en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6 (DAKO). Tras el lavado, las secciones se incubaron con el anticuerpo anti-Coneja conjugado con fosfatasa y el procedimiento de revelado fue asistido por la máquina TechMate 500. Por último, las secciones se tiñeron con hematoxilina/eosina.
Se examinaron al microscopio diez islotes pancreáticos por rata y se contó el número de células positivas y negativas a la insulina numerando sus núcleos. Los datos se expresan como el porcentaje de células inmunopositivas a la insulina/número total de células en cada islote.
2.5. Análisis estadístico
La significación de las diferencias entre los distintos grupos se evaluó mediante un análisis de la varianza (ANOVA) de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, y el valor se tomó como significativo a nivel.
3. Resultados
El efecto del tratamiento con VOSO4 sobre los niveles de glucosa en sangre en ratas no diabéticas (ND) y diabéticas (D) se muestra en la figura 1. No hubo cambios significativos en los niveles de glucosa en sangre en el grupo ND de control durante el tratamiento (Figura 1(a)). El tratamiento de las ratas ND con VOSO4 a 5 o 10 mg/Kg no cambió significativamente los niveles de glucosa en sangre durante los primeros 10 días. Sin embargo, el nivel de glucosa en sangre disminuyó significativamente al final del tratamiento con la dosis de 5 mg/Kg y se redujo significativamente de los 15 a los 30 días con la dosis de 10 mg/Kg en comparación con el grupo ND de control. En el día 30, la disminución de la glicemia fue de aproximadamente 8 y 15%, respectivamente, para las dosis de 5 y 10 mg/Kg en comparación con el grupo de control. Como se sospechaba, se observó un notable aumento del nivel de glucosa en sangre en las ratas control tratadas con STZ en comparación con los animales no tratados ( frente a mg/dL) lo que indica la instalación de la diabetes que se mantuvo durante todo el experimento. El tratamiento del grupo diabético (D) con 5 mg/Kg de VOSO4 redujo significativamente el nivel de glucosa en sangre a partir del día 10, mientras que una dosis de 10 mg/Kg disminuyó el nivel de glucosa en sangre de forma significativa y gradual a partir del día 5 hasta alcanzar el nivel normal en el día 30. Los valores anotados de glicemia a los 30 días fueron y frente a mg/dL, respectivamente, en los grupos D + 5, D + 10 y control D (Figura 1(b)).
La Tabla 1 mostró los niveles de insulina en los grupos ND y D sin y tras el tratamiento con VOSO4. Las ratas ND tratadas con 5 mg/Kg de VOSO4 no mostraron cambios significativos en el nivel de insulinemia, pero se obtuvo un marcado aumento con 10 mg/Kg en comparación con el grupo ND control ( frente a µg/L). Además, en el grupo D, la insulinemia disminuyó profundamente en comparación con los animales ND de control ( frente a µg/L). La administración de VOSO4 en los grupos D aumentó notablemente la insulinemia de forma dependiente de la dosis. De hecho, los niveles de insulina aumentaron en las ratas diabéticas de a y µg/L con, respectivamente, dosis de 5 mg y 10 mg/Kg.
Los cambios en la sensibilidad a la insulina tras la inyección ip de insulina (1 U/Kg) en animales normales y tratados con diabetes se muestran en la Figura 2. En las ratas ND, el tratamiento con 10 ó 5 mg de VOSO4 no alteró el perfil de glicemia en respuesta a la administración de insulina (Figura 2(a)). De hecho, en estos grupos, el efecto hipoglucémico máximo de la insulina se observó a los 60 y 90 min, respectivamente, y fue aproximadamente del valor de la glicemia inicial. Los animales diabéticos tratados con la dosis baja de VOSO4 mostraron un perfil de glicemia similar al del grupo D de control, con una disminución máxima a los 60 min, mientras que los tratados con la dosis alta mostraron una disminución máxima significativa () y rápida de la glicemia a los 30 min después de la inyección de insulina (Figura 2(b)).
En los grupos de tratamiento con VOSO4, se observó que el tamaño de los islotes pancreáticos era mayor en comparación con sus respectivos grupos ND y D de control (Figuras 3 y 4). Los análisis estadísticos mostraron que los tratamientos con VOSO4 indujeron un marcado aumento del número de células inmunopositivas a la insulina, en torno al 20% en los grupos ND + 5 y al 27% en los grupos ND + 10 mg/Kg (Figura 5). El tratamiento con VOSO4 aumentó significativamente el número de células inmunopositivas a la insulina en los grupos de diabéticos con STZ de forma dependiente de la dosis en un 12 y 23%, respectivamente, con dosis de 5 y 10 mg/Kg (Figura 5). La comparación entre los grupos tratados con STZ-diabéticos y las ratas de control ND no indicó diferencias significativas.
(a)
(b)
(c)
Tinción inmunohistoquímica de la insulina en las células beta de los islotes de Langerhans pancreáticos de ratas diabéticas con STZ-ratas diabéticas. Obsérvese que hay más células inmunopositivas a la insulina en las ratas diabéticas tratadas con STZ que en las ratas diabéticas no tratadas con STZ. Control D (a), D tratado con 5 mg/Kg de VOSO4 (b), y D tratado con 10 mg/Kg de VOSO4 (c). Se analizaron diez islotes por rata. Barra de escala: 50 µm.
Efecto del sulfato de vanadilo sobre el número de células beta en %. Los valores representan la media ± SD. ; frente al control ND. ; frente al control D. frente a D + 5 mg/Kg. Se analizaron 10 islotes por rata.
4. Discusión
Estudiamos las propiedades antidiabéticas del vanadio explorando sus efectos sobre los niveles de glucosa e insulina en sangre, así como sobre las células B del páncreas endocrino.
Usando ratas diabéticas inducidas por STZ, demostramos que el tratamiento con sulfato de vanadilo (VOSO4) a 5 y 10 mg/Kg redujo significativamente los niveles medios de glucosa en sangre a los 10 y 5 días, respectivamente, en comparación con el grupo de control no tratado. En el día 30, las ratas diabéticas a las que se les administró la dosis más alta del compuesto mostraron un nivel de glucemia similar al de los animales de control ND. Sin embargo, en las ratas ND, el tratamiento con la dosis más baja de VOSO4 no cambió significativamente el nivel de glucosa en sangre, mientras que la dosis más alta indujo una pequeña y gradual disminución en el día 15 de tratamiento y la glicemia se redujo en aproximadamente un 14% en el día 30. Nuestros resultados concuerdan con datos anteriores que demuestran que la administración oral de compuestos de vanadio en animales diabéticos inducidos por STZ o heredados genéticamente o por nutrición mejoró significativamente la hiperglucemia . En humanos, Soveid et al. informaron de la seguridad y la eficacia de la terapia con sulfato de vanadio por vía oral durante un periodo de 30 meses en pacientes diabéticos de tipo 1, disminuyendo la necesidad de insulina y el nivel de glucosa en sangre.
Nuestro estudio también reveló que el efecto hipoglucémico del VOSO4 iba acompañado de un marcado aumento del nivel de insulinemia basal en el grupo diabético de forma dependiente de la dosis. Con la dosis de 10 mg, el nivel de insulinemia de las ratas diabéticas se normalizó prácticamente. De hecho, la disminución de los niveles de glucosa en sangre registrada especialmente en las ratas diabéticas expuestas al compuesto de vanadio puede estar relacionada con el aumento concomitante de las concentraciones de insulina en plasma. Estos resultados concuerdan con los datos anteriores sobre la eficacia de los compuestos de vanadio para mejorar el estado diabético.
Además, hemos investigado el efecto de la administración de vanadio sobre la sensibilidad a la insulina en ratas diabéticas y no diabéticas. En los grupos ND, mostramos un efecto hipoglucémico máximo de la insulina a los 60-90 min de la introducción de la hormona. Sin embargo, en los grupos D, el tratamiento con VOSO4 con una dosis de 10 mg mejoró la sensibilidad a la insulina con una disminución más rápida y pronunciada de la glucosa en sangre tras la inyección de la hormona, mientras que la dosis de 5 mg no cambió significativamente la respuesta a la glucemia de las ratas D. La mejora de la sensibilidad a la insulina inducida por VOSO4 está en consonancia con numerosos estudios que indican que el vanadio puede considerarse como un potente mimético de la insulina o trófico de la insulina en diversos tejidos.
Se ha demostrado que los compuestos de vanadio se caracterizan por tener múltiples vías de acción que dan lugar a la disminución de la glucemia. Estudios in vivo e in vitro informaron de que el sulfato de vanadio aumentaba el transporte y el metabolismo de la glucosa en los músculos esqueléticos, el hígado y los tejidos adiposos . Gracias a su similitud estructural con los aniones ortofosfato, los derivados orgánicos del vanadio inhiben la proteína fosfotirosina fosfatasa . También inhiben la actividad de la PTP-1B, enzima responsable de la desfosforilación del receptor de la insulina, lo que provoca una resistencia a la misma. Otro mecanismo de reducción de los niveles de glucosa en sangre por parte de los compuestos de vanadio es la activación de la quinasa PKB/Akt que conduce al aumento de la captación de glucosa por el transportador GLUT4 . La activación de PKB/Akt estimula también la fosforilación de GSK3, lo que resulta en la estimulación de la síntesis de glucógeno. Por otra parte, se descubrió que la inhibición de la cinasa N-terminal C-jun mejora la sensibilidad a la insulina en la diabetes experimental .
El vanadio aumenta el transporte y la oxidación de la glucosa y la actividad de la tirosina-cinasa del receptor de insulina y ejerce efectos similares a los de la insulina en los metabolismos de la glucosa y los lípidos por vías bioquímicas dependientes o independientes de la insulina .
Es bien sabido que el tratamiento con STZ destruye las células beta de los islotes pancreáticos induciendo una diabetes mellitus dependiente de la insulina . Así, en el presente estudio, mostramos una reducción del área de los islotes pancreáticos asociada a una marcada disminución del número de células beta inmunorreactivas para la insulina en el grupo diabético en comparación con los animales de control no diabéticos. Sin embargo, en los grupos ND y D, el tratamiento con VOSO4 aumentó el tamaño de los islotes pancreáticos en comparación con los respectivos grupos de control. Y lo que es más importante, el tratamiento con VOSO4 de las ratas diabéticas aumentó de forma dependiente de la dosis el número de células beta inmunopositivas a la insulina, a diferencia del grupo diabético no tratado, lo que sugiere que el VOSO4 puede generar las células beta en las ratas diabéticas inducidas por STZ. De hecho, el número de células beta en los islotes de las ratas diabéticas tratadas con VOSO4 con 5 y 10 mg no fue significativamente diferente al del grupo ND. Esto concuerda con investigaciones anteriores sobre la propiedad insulinotrópica pancreática de este compuesto. Curiosamente, el tratamiento con vanadio también incrementó significativamente el número de células beta en los islotes de las ratas no diabéticas.
En un modelo de páncreas de segmento perfundido con aloxano en ratones, Waguri et al. informaron de procesos de regeneración de células beta a partir de células precursoras extra-islote. De hecho, en ratas diabéticas con STZ, el tratamiento con VOSO4 podría estimular la proliferación de células beta a partir de células endocrinas intraislet y la diferenciación a partir de células precursoras extraislet.
En conclusión, el presente estudio demuestra que el sulfato de vanadilo podría ser útil como agente antidiabético potencial. Sin embargo, como las evidencias actuales son todavía limitadas y se basan principalmente en modelos animales y se sabe poco sobre las formulaciones terapéuticas y los efectos secundarios de los compuestos de vanadio, se necesitan más investigaciones sobre su uso a largo plazo como terapia convencional para pacientes diabéticos.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este trabajo.
Agradecimientos
Este trabajo ha contado con el apoyo del Ministerio de Educación Superior e Investigación Científica de Túnez.