Las esclusas del canal funcionan por el flujo de agua por gravedad de los lagos Gatún, Alajuela y Miraflores, que son alimentados por el Chagres y otros ríos. Las esclusas tienen una longitud, anchura y profundidad uniformes y fueron construidas en pares para permitir el tránsito simultáneo de embarcaciones en ambas direcciones. Cada compuerta de la esclusa tiene dos hojas, de 20 metros de ancho y 2 metros de grosor, colocadas sobre bisagras. La altura de las compuertas oscila entre 14 y 25 metros, y su movimiento se realiza mediante motores eléctricos empotrados en las paredes de la esclusa. Se accionan desde una torre de control, situada en el muro que separa cada par de esclusas y desde la que también se controla la inundación o el vaciado de las cámaras de las esclusas. Las cámaras de las esclusas tienen 1.000 pies (300 metros) de longitud, 110 pies (33 metros) de ancho y 40 pies (12 metros) de profundidad.

Debido a la naturaleza delicada de los mecanismos originales de las esclusas, sólo las embarcaciones pequeñas pueden pasar por ellas sin ayuda. Las embarcaciones más grandes son guiadas por locomotoras eléctricas de remolque, que funcionan sobre vías dentadas en las paredes de la esclusa y sirven para mantener los barcos centrados en la esclusa. Antes de poder entrar en una esclusa, hay que pasar una cadena de defensa, tendida entre las paredes de la aproximación. Si todo va bien, esa cadena caerá en su ranura en el fondo del canal. Si por casualidad el barco se mueve demasiado rápido para la seguridad, la cadena permanecerá estirada y el barco correrá contra ella. La cadena, que es operada por una maquinaria hidráulica en las paredes, entonces se liberará lentamente por la liberación automática hasta que el buque se haya detenido. Si el buque se aleja de la locomotora de remolque y, rompiendo la cadena, embiste la primera compuerta, una segunda compuerta a 15 metros de distancia protegerá la esclusa y detendrá su avance.

Los sistemas de la tercera esclusa del Proyecto del Tercer Juego de Esclusas, iniciado en 2007, se inspiraron en la esclusa de Berendrecht en Amberes (Bélgica) y en las cuencas de ahorro de agua utilizadas en los canales de Alemania. Unas 190.000 toneladas de acero, en su mayor parte procedente de México, se han encastrado en hormigón fuertemente reforzado para construir las cámaras de las esclusas en los lados Atlántico y Pacífico, y las nuevas compuertas de las esclusas miden hasta 33 pies (10 metros) de ancho, 98 pies (30 metros) de alto y 190 pies (58 metros) de largo. Las nuevas cámaras y cuencas, que controlarán el agua que fluye desde el lago Gatún, fueron diseñadas para minimizar la turbulencia del flujo de agua y la perturbación de los buques en tránsito. Las cuencas se completaron en junio de 2016 e incluyen 158 válvulas compuestas por 20.000 toneladas de material estructural. Las autoridades afirman que estas cuencas de ahorro de agua son las mayores del mundo y facilitan una reutilización del 60% del agua. Mientras que las esclusas existentes utilizan 52 millones de galones (197 millones de litros) con cada uso, las nuevas esclusas utilizan 48 millones de galones (182 millones de litros).