Les écluses du canal fonctionnent grâce à l’écoulement gravitaire de l’eau des lacs Gatún, Alajuela et Miraflores, qui sont alimentés par le Chagres et d’autres rivières. Les écluses elles-mêmes sont de longueur, de largeur et de profondeur uniformes et ont été construites par paires pour permettre le transit simultané de navires dans les deux sens. Chaque porte d’écluse comporte deux battants, de 20 mètres de large et de 2 mètres d’épaisseur, montés sur charnières. Les portes ont une hauteur de 14 à 25 mètres et sont actionnées par des moteurs électriques encastrés dans les murs de l’écluse. Elles sont actionnées à partir d’une tour de contrôle, située sur le mur qui sépare chaque paire d’écluses et à partir de laquelle l’inondation ou la vidange des sas est également contrôlée. Les sas d’écluses mesurent 1 000 pieds (300 mètres) de long, 110 pieds (33 mètres) de large et 40 pieds (12 mètres) de profondeur.

En raison de la nature délicate des mécanismes d’écluses d’origine, seules les petites embarcations sont autorisées à passer les écluses sans assistance. Les plus grandes embarcations sont guidées par des locomotives de remorquage électriques, qui fonctionnent sur des rails à crémaillère sur les murs de l’écluse et servent à maintenir les navires centrés dans l’écluse. Avant de pouvoir entrer dans une écluse, il faut passer une chaîne de défense, tendue entre les murs d’approche. Si tout se déroule correctement, cette chaîne sera déposée dans sa rainure au fond du canal. Si, par hasard, le navire se déplace trop rapidement pour être sûr, la chaîne restera tendue et le navire se heurtera à elle. La chaîne, qui est actionnée par des machines hydrauliques situées dans les murs, se déroulera alors lentement par déclenchement automatique jusqu’à ce que le navire se soit immobilisé. Si le navire devait s’éloigner de la locomotive de remorquage et, en brisant la chaîne, éperonner la première porte, une deuxième porte située à 50 pieds (15 mètres) de distance protégera l’écluse et arrêtera toute nouvelle avancée.

Les systèmes de la troisième série d’écluses du projet du troisième jeu d’écluses, commencé en 2007, ont été inspirés par l’écluse de Berendrecht à Anvers, en Belgique, et les bassins économiseurs d’eau utilisés dans les canaux en Allemagne. Quelque 190 000 tonnes d’acier, provenant principalement du Mexique, sont enfoncées dans du béton fortement armé pour construire les sas d’écluse des côtés Atlantique et Pacifique, et les nouvelles portes d’écluse mesurent jusqu’à 10 mètres de large, 30 mètres de haut et 58 mètres de long. Les nouvelles chambres et les nouveaux bassins, qui contrôleront l’eau s’écoulant du lac Gatún, ont été conçus pour minimiser les turbulences de l’écoulement de l’eau et la perturbation des navires en transit. Les bassins ont été achevés en juin 2016 et comprennent 158 vannes constituées de 20 000 tonnes de matériaux structurels. Les responsables affirment que ces bassins d’économie d’eau sont les plus grands au monde et facilitent une réutilisation de l’eau à 60 %. Alors que les écluses existantes utilisent 52 millions de gallons (197 millions de litres) à chaque utilisation, les nouvelles écluses utilisent 48 millions de gallons (182 millions de litres).