Depth of Field

La conséquence de l’ouverture numérique est qu’elle est directement liée à la profondeur de champ (DOF). Pour un objectif donné, en regardant un échantillon, il y a un plan particulier de mise au point parfaite. La profondeur de champ est, à quelle distance au-dessus et au-dessous de ce plan, l’objectif et l’échantillon peuvent être et avoir encore tout au point.

La même chose se produit en photographie traditionnelle, une très petite ouverture va augmenter la profondeur de champ. Une ouverture numérique plus élevée donnera une plus grande résolution, mais la profondeur de champ devient considérablement plus petite. Il existe une distance au-dessus du plan de l’échantillon et une distance au-dessous du plan de l’échantillon, et n’importe où entre ces deux distances, la mise au point est essentiellement parfaite. Dès que l’objectif et l’échantillon sont en dehors de cette limite, l’image commence à se brouiller.

C’est ce qu’on appelle la profondeur de champ. La formule pour la profondeur de champ est :

où :
« n » est l’indice de réfraction du matériau entre l’objectif et l’échantillon
λ (lambda) est la longueur d’onde de la lumière
NA est l’ouverture numérique

Dans la plupart des cas, le matériau entre l’objectif et l’échantillon est l’air, et « n » est égal à 1,00. Pour l’eau, son indice de réfraction est de 1,33, et l’huile d’immersion spécialisée pour la microscopie est de 1,52. Pour un objectif à faible grossissement tel qu’un 4X ou même un 10X, la profondeur de champ typique est de plus ou moins 3 à 5 microns. Dans ce cas, si l’échantillon est très plat, il se peut que la mise au point ne soit pas du tout nécessaire, ou qu’elle ne doive se faire qu’une seule fois. En général, les échantillons varient en épaisseur et ils varient en planéité, donc la focalisation est nécessaire.

Pour un grossissement de 20X, qui peut être une ouverture numérique de 0,6 à 0,8, la profondeur de champ tombe à environ plus ou moins 500 nanomètres. Si l’on passe à un fort grossissement avec une immersion dans l’huile à une ouverture numérique de 1,47, la profondeur de champ chute de façon très spectaculaire. La profondeur de champ peut être de plus ou moins 0,1 à 0,2 micron (100 à 200 nm). C’est une tolérance très serrée. À 100 nanomètres ou 200 nanomètres, de minuscules variations de la planéité ou de la hauteur de l’échantillon, ou encore de la précision des glissières de la platine de mouvement XY de l’échantillon, rendront la mise au point difficile. Pour maintenir la mise au point dans cette situation, un système autofocus laser à suivi continu connecté à une platine de mise au point d’objectif à large bande passante, comme le DOF-5, est le moyen idéal de maintenir la mise au point dans ces applications à ouverture numérique élevée et à haute résolution.