3.53.4.3 Thérapie synthétique par les phages
Les bactériophages, ou simplement appelés phages, ont joué un rôle central dans le développement de la biologie moléculaire, de la génétique bactérienne et ont fourni les premiers outils de recombinaison des molécules d’ADN, tels que les enzymes de restriction et les ligases. Au cours de la dernière décennie, l’étude des mécanismes de résistance des phages a conduit à la découverte de l’une des plus importantes technologies habilitantes pour la SB depuis la PCR, à savoir les systèmes de nucléases CRISPR, que les bactéries et les archées ont évolué comme une défense adaptative à l’ADN exogène. L’identification récente de nombreux autres systèmes antiphages non caractérisés jusqu’alors pourrait fournir d’autres technologies révolutionnaires pour les applications de la SB.45 Dans ce contexte historique, il est donc approprié que la SB soit maintenant appliquée aux phages afin de perfectionner leur utilisation en tant qu’agents thérapeutiques.
Les phages ont été découverts indépendamment par Frederik Twort et Félix D’Hérelle au début du 20ème siècle46,47 et peu après, ils ont été utilisés comme agents antimicrobiens pour traiter des maladies infectieuses telles que le choléra et la peste. En Europe de l’Est, la phagothérapie est devenue courante et plusieurs centres de traitement renommés existent encore aujourd’hui, par exemple en Géorgie et en Pologne. En Occident, après quelques succès initiaux sporadiques, la phagothérapie a cessé d’être utilisée lorsque les antibiotiques sont devenus largement disponibles. Aujourd’hui, avec l’augmentation des agents pathogènes résistants aux antimicrobiens, initialement les souches dites ESKAPE48 mais maintenant un ensemble encore plus large d’agents pathogènes49 qui, selon les prévisions, entraîneront plus de décès que le cancer d’ici 2050, il y a un regain d’intérêt pour la thérapie par les phages.
L’utilisation de phages présente plusieurs avantages par rapport aux antibiotiques, principalement la possibilité de cibler des souches spécifiques et de laisser ainsi la communauté microbienne bénéfique intacte, ainsi que la possibilité de surmonter la résistance en utilisant des cocktails de phages complémentaires, en « entraînant » les phages sur des souches hôtes sélectionnées ou simplement en isolant de nouveaux phages contre un agent pathogène. Inversement, il existe plusieurs obstacles à surmonter et des domaines à améliorer pour que la phagothérapie devienne un médicament fiable et largement adopté en Occident, tels que : des essais cliniques solides avec des contrôles appropriés, la réduction du temps d’identification des phages avec la gamme d’hôtes appropriée, le dépassement de la résistance aux phages et des mécanismes d’exclusion de la souche cible sans avoir besoin de cocktails complexes, le contournement des réponses immunitaires indésirables aux particules de phages et la limitation de la transduction généralisée des gènes de résistance aux antibiotiques ou des facteurs de virulence bactérienne. Même dans le cas d’une destruction réussie d’une souche cible, la lyse rapide d’un grand nombre de bactéries et la libération concomitante d’endotoxines et de superantigènes peuvent entraîner une forte réponse inflammatoire et un résultat clinique défavorable.
L’organisation hautement modulaire des génomes de phages et l’assemblage de la structure du phage en modules fonctionnels, tels que les fibres de la queue, les pointes, les tubes de la queue et la capside, font des phages des cibles idéales pour les approches SB, dans un sens les génomes de phages sont déjà organisés en BioBricks. Dans un premier modèle pour la conception de futurs phages synthétiques, le phage filamenteux Pf3 a été modifié pour traiter l’infection par Pseudomonas aeruginosa dans un modèle de souris50 . Un gène de protéine d’exportation de Pf3 a été remplacé par un gène codant pour l’endonucléase de restriction BglII, avec le raisonnement que (1) ce remplacement de gène rend Pf3 non réplicatif, introduisant ainsi une stratégie de confinement, (2) le phage peut être propagé de manière stable dans un hôte contenant le gène de la méthylase BglII et (3) le BglII catalyserait les cassures double brin dans l’ADN génomique de la souche cible pour la tuer. Un résultat important de cette étude est que le traitement des souris infectées avec le phage Pf3R ou avec un phage lytique a donné des chances de survie comparables pour des souris exposées à une dose létale minimale de 3, mais à une dose létale minimale de 5, le taux de survie était significativement meilleur avec la thérapie par phage Pf3R. L’analyse des niveaux de cytokines sériques a indiqué une réponse inflammatoire réduite, indiquant que le meilleur résultat pour le groupe de traitement Pf3R est dû à la destruction efficace de la souche cible sans lyse et libération d’endotoxine.
La destruction de P. aeruginosa par Pf3R repose sur la gamme d’hôtes du phage pour fournir une spécificité de ciblage, car on s’attendrait à ce que les sites de restriction BglII soient présents dans essentiellement tous les génomes bactériens. Une amélioration est suggérée par la découverte remarquable d’un bactériophage qui a obtenu un système CRISPR/Cas, d’une source inconnue, pour son propre usage.51 Le système CRISPR/Cas codé par le phage est capable d’acquérir de nouveaux espaceurs et la nucléase CAS3 a été reciblée sur un élément chromosomique que son hôte, Vibrio cholera, utilise pour son immunité innée. À la suite de cette découverte, le système CRISPR de type II de Streptococcus pyogenes a été intégré au bactériophage M13 avec des espaceurs pour cibler des séquences de résistance aux antibiotiques et des gènes de virulence chez Escherichia coli, les auteurs désignant ces dispositifs comme des nucléases guidées par l’ARN (RGN).52 Démontrant la spécificité exquise de ce système, une RGN a été capable de tuer de manière discriminatoire une souche présentant un polymorphisme nucléotidique unique dans l’ADN gyrase qui confère une résistance aux quinolones. De plus, dans un consortium artificiel de trois souches bactériennes, ils ont été capables de tuer des souches sélectionnées (400 à 20 000 fois par rapport aux contrôles) tout en laissant les autres membres du consortium intacts. La spécificité de la destruction médiée par CRISPR/Cas pourrait étendre la phagothérapie au-delà du ciblage des agents pathogènes à la modulation précise des microbiomes humains, dont la composition a été impliquée dans le pronostic de certains cancers et même de troubles neurologiques tels que l’autisme, la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer via l’axe intestin-cerveau.
Une plateforme idéale de phage synthétique pourrait être une plateforme dans laquelle la liaison à la gamme d’hôtes est conçue pour être très large tandis que la spécificité du ciblage de la souche est fournie par la charge utile CRISPR/Cas. De cette façon, les phages pourraient être facilement déployés pour les traitements, sans qu’une nouvelle plateforme doive être isolée ad hoc pour chaque pathogène. En outre, la large gamme d’hôtes combinée aux réseaux CRISPR ciblant plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques ou de virulence pourrait permettre l’utilisation d’une phagothérapie présomptive, c’est-à-dire avant l’identification de l’agent pathogène. Les stratégies d’extension de la gamme d’hôtes comprennent des cribles génétiques avancés pour identifier les récepteurs des phages et les facteurs hôtes nécessaires,53 l’extraction de séquences de protéines de liaison aux récepteurs (RBP) des prophages à partir de génomes bactériens et le redémarrage de phages synthétiques qui pourraient, par exemple, coder pour des bibliothèques de protéines de liaison aux récepteurs (RBP) pour le HTS54,55. Le masquage des récepteurs par les capsules peut être surmonté par l’expression d’enzymes hydrolysant les exopolysaccharides56 et d’autres enzymes pour dégrader les biofilms57, tandis que d’autres mécanismes de masquage et la variation de phase dans l’expression des récepteurs peuvent être surmontés par des phages conçus avec plusieurs fibres de queue contenant différentes RBP ou des RBP vers des cibles de surface cellulaire non canonique hautement conservées. Les bactéries déploient de nombreux systèmes anti-phages, les principaux étant l’immunité innée de la restriction-modification et l’immunité adaptative de CRISPR/CAS, mais inversement les phages ont aussi contre-évolué de multiples stratégies pour vaincre ces systèmes comme l’utilisation de nucléotides non-canoniques dans leur ADN, ayant moins de sites de restriction ou hyper méthylant leurs génomes et délivrant des protéines qui inhibent les enzymes de restriction ou améliorent les enzymes de méthylation de l’hôte.
La plateforme de phages synthétiques décrite ici éviterait le recours à des cocktails de phages pour lesquels l’approbation réglementaire peut être plus complexe. Les cibles restantes pour l’ingénierie phagique sont génériques à de nombreux produits biologiques, comme la stabilité et la réponse du système immunitaire. Les cellules phagocytaires, en particulier, sont responsables de l’élimination des particules de phages du système circulatoire. Des mutants de phages à longue circulation ont été obtenus par une technique de passage en série58 et se sont révélés être mutés dans la principale protéine de capside. Plus tard, une modification d’un seul acide aminé, également dans une protéine de capside, introduite par manipulation génétique directe, a permis de multiplier par 13 000 à 16 000 la capacité du phage à rester dans le système circulatoire de la souris59. D’autres paramètres permettant d’améliorer les phages en tant qu’agents thérapeutiques, tels que la production, la formulation et la voie d’administration, sortent probablement du cadre des activités du SB, mais les leçons tirées des travaux précédents avec les phages natifs s’appliqueront également aux phages conçus par le SB.
Au cours de la dernière décennie, avec le regain d’intérêt pour la thérapie par les phages et les rapports sporadiques de cas individuels de patients réussis, il y a eu des tentatives d’effectuer des essais cliniques contrôlés qui n’ont donné lieu à aucun effet indésirable significatif, mais l’efficacité n’a toujours pas été démontrée avec insistance. Ce sera un prochain article passionnant de l’histoire de la thérapie par les phages, qui a commencé il y a plus de 100 ans, de voir les phages modifiés par SB entrer dans les essais cliniques.