La mort cellulaire est cruciale pour la bonne exécution des processus normaux et pathophysiologiques et est omniprésente dans les systèmes biologiques.

Les formes programmées de mort cellulaire sont responsables de la production de modèles morphologiques pendant le développement, de la sélection négative pendant l’immunité et de la « course aux armements » moléculaire qui se produit entre les gènes viraux et ceux de l’hôte pendant l’infection, ainsi que des dommages tissulaires qui se produisent avec les facteurs de stress environnementaux tels que les génotoxines.

Les altérations au sein de ces voies de mort cellulaire peuvent se manifester sous forme de maladies, notamment le cancer, les troubles dégénératifs et le syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). La capacité des cellules tumorales à échapper à la mort cellulaire programmée est une caractéristique de la plupart des types de cancer.

Ces dernières années, il est devenu clair que la simple mesure des caractéristiques individuelles des cellules mourantes, telles que la fragmentation nucléaire ou la perméabilité membranaire, n’est pas suffisante pour discriminer les différentes voies de mort cellulaire, qui comprennent l’apoptose, la mort cellulaire autophagique et la nécrose.

Ce qu’il faut, c’est une évaluation multiparamétrique de la mort cellulaire qui révèle les événements mécanistes qui se produisent « en coulisse ». Selon les recommandations du Comité de nomenclature sur la mort cellulaire 2009, les processus liés à la mort cellulaire (apoptose, nécrose, autophagie) peuvent être classés en fonction de l’aspect morphologique, des critères enzymologiques, des aspects fonctionnels et des caractéristiques immunitaires.

La mort cellulaire sous diverses formes

Apoptose

L’apoptose fait référence à un programme de suicide cellulaire dirigé par les gènes. Une grande variété de protéines cellulaires, notamment des récepteurs de surface cellulaire, des protéases et des composants mitochondriaux, régulent un équilibre délicat entre la survie cellulaire et la mort par apoptose. Des mutations au sein de ces protéines peuvent faire basculer l’équilibre, entraînant la survie et la prolifération incontrôlées des cellules tumorales. Par conséquent, la découverte des mécanismes de l’apoptose peut donner lieu à de nouvelles stratégies pour exploiter cette forme de mort cellulaire à des fins thérapeutiques.

L’apoptose s’accompagne d’une réduction du volume cellulaire, d’une condensation nucléaire, d’une fragmentation de l’ADN, d’un saignement de la membrane plasmique et d’un engloutissement par les phagocytes. De plus, l’apoptose implique typiquement une perméabilisation de la membrane mitochondriale, suivie de l’activation de la cascade des caspases ; cependant, des protéases non caspases peuvent être alternativement activées.

Nécrose

La nécrose était historiquement considérée comme une forme passive de mort cellulaire. Cependant, des données récentes suggèrent que la nécrose peut également être une forme alternative de mort cellulaire programmée dont l’activation peut avoir des conséquences importantes, comme l’induction d’une réponse inflammatoire. La nécrose et l’apoptose sont morphologiquement très distinctes. La nécrose s’accompagne d’un gain de volume cellulaire, d’un gonflement des organites, d’une rupture de la membrane plasmique et d’une perte du contenu intracellulaire.

En ce qui concerne la différence entre l’apoptose et la nécrose, les différentes méthodes de distinction entre la mort cellulaire apoptotique et nécrotique reposent sur des éléments caractéristiques qui peuvent être visualisés et/ou mesurés, tels que la taille des cellules, la fragmentation cellulaire et le clivage de l’ADN.

Autophagie

L’autophagie est un processus de dégradation homéostatique hautement régulé où les cellules détruisent leurs propres composants via la machinerie lysosomale et les recyclent. Ce processus est associé à diverses maladies, notamment la maladie d’Alzheimer, le vieillissement, les cancers et la maladie de Crohn. Dans certains cas, une autophagie élevée contribue à la mort cellulaire en interagissant avec les voies de signalisation pro-apoptotiques. La compréhension de la corrélation entre l’autophagie et la mort cellulaire apoptotique fait l’objet de nombreuses recherches, notamment en biologie tumorale.

Autophagie vs Apoptose

La mort cellulaire autophagique est définie morphologiquement comme une mort cellulaire qui se produit en l’absence de condensation de la chromatine mais qui s’accompagne d’une vacuolisation massive du cytoplasme. Contrairement à l’apoptose, l’autophagie est peu ou pas associée aux phagocytes. Au cours de cette forme de mort cellulaire, le matériel cytoplasmique est séquestré dans les autophagosomes pour être dégradé par les lysosomes.

On sait maintenant qu’il existe une diaphonie entre les voies de l’apoptose et de l’autophagie, et des études ont montré que BCL2, qui est un régulateur important de l’apoptose, est également un régulateur important de la voie de l’autophagie.

Les progrès récents en biologie chimique, en analyse des voies et en cytométrie sophistiquée ont permis de mieux comprendre les marqueurs moléculaires et les changements cellulaires qui caractérisent chaque voie de mort cellulaire. En outre, l’évolution de la technologie a également rendu possible la réalisation d’un grand nombre de ces évaluations en tant qu’expériences de routine sur banc, en ligne avec les analyses en aval. Ensemble, ces progrès ont transformé l’étude de la mort cellulaire en dissection de réseaux de signalisation nuancés qui sont intégrés dans des systèmes complexes.

L’une des caractéristiques essentielles de la mort cellulaire que la communauté scientifique tente de disséquer est le point de non-retour le long de ces voies nuancées. Il existe des points réversibles et irréversibles le long de chaque voie de signalisation de la mort cellulaire et déterminer où se situe le point de transition dans divers contextes est d’une grande importance si l’on veut tenter d’intervenir dans le processus. Quel que soit le type de mort cellulaire, une fois que la cellule a dépassé le point de non-retour, la mort ne peut être empêchée.

Analyser la mort cellulaire

Afin de disséquer, caractériser et différencier les différentes formes de mort cellulaire, deux types de critères sont nécessaires : descriptifs (ex : imagerie) et fonctionnels (ex : inhibition de voies). Par exemple, la fragmentation de l’ADN et l’activation de la caspase peuvent chacune aider à définir l’apoptose, mais ces analyses ne sont pas définitives lorsqu’elles sont utilisées de manière isolée car l’apoptose peut se produire sans fragmentation de l’ADN, et l’activation de la caspase est également liée à d’autres processus biologiques.

Par conséquent, la mort cellulaire doit toujours être mesurée à l’aide de plusieurs méthodes, de préférence dans le même échantillon, en combinant les analyses biochimiques et morphologiques lorsque cela est possible. Une gamme de technologies peut fournir des informations précieuses sur les différentes voies de mort cellulaire, y compris l’imagerie, TUNEL, les tests basés sur l’immunologie, la cytométrie de flux, la cytométrie basée sur l’imagerie et les technologies d’imagerie des cellules adhérentes. Cependant, il existe quelques inconvénients communs et inhérents aux méthodes actuelles d’investigation de la mort cellulaire qui peuvent limiter leur utilité.

Par exemple, les technologies telles que le Western Blotting et l’ELISA ne sont pas en mesure de fournir des changements spécifiques par cellule, bien qu’elles soient très utiles pour recueillir des informations sur le changement total du processus. Certaines méthodes d’imagerie peuvent présenter des limitations quant au fait qu’un nombre équivalent de cellules soit compté d’un échantillon à l’autre, ou qu’un nombre suffisant de cellules soit compté, ce qui pourrait avoir un impact sur la reproductibilité et/ou la précision des résultats.

À l’autre extrémité, des méthodes telles que la cytométrie de flux multiparamétrique ou la cytométrie d’imagerie peuvent être très puissantes et fournir des données riches en contenu pour les analyses de la mort cellulaire, mais ces méthodes peuvent également présenter des limitations. Par exemple, l’accès à l’instrumentation peut être limité, il peut y avoir un besoin de beaucoup d’expertise et de formation, et l’accessibilité financière peut être un défi.

Il existe un besoin dans l’industrie pour des méthodologies faciles à utiliser, abordables et accessibles qui peuvent fournir de manière robuste, précise et reproductible des réponses aux questions communes et quotidiennes que les chercheurs étudient dans la santé et la mort cellulaire. Les méthodes établies et émergentes permettant de discriminer efficacement l’apoptose, la nécrose et l’autophagie sont décrites ci-dessous.

Imagerie

La mort cellulaire est finalement un processus morphologique et l’étalon-or pour analyser ce processus est de visualiser les cellules. Lorsque la mort cellulaire est observée en culture, il devient très évident de savoir ce qui se passe. Par exemple, pendant l’apoptose, les cellules s’arrondissent et semblent bouillir (« blebbing »). Il existe de multiples approches pour imager la mort cellulaire, notamment la simple visualisation des cellules en temps réel en culture, la coloration des cellules avec de l’acridine orange (un colorant vital spécifique des cellules apoptotiques), la coloration histologique de tissus fixés et la microscopie électronique. De nouvelles options sont également disponibles en cytométrie d’image, comme décrit plus loin.

Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)

La procédure TUNEL (Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling) est une méthode très courante pour examiner la fragmentation de l’ADN qui résulte de l’apoptose. TUNEL marque les extrémités terminales de l’ADN qui sont clivées dans la région d’espacement entre les nucléosomes de la chromatine, et ces ruptures de brins d’ADN sont visualisées par microscopie optique. Bien que le TUNEL soit un test très efficace pour l’apoptose, une limitation majeure de cette approche est que le TUNEL détecte les cellules apoptotiques au dernier stade du processus.

Activation des caspases

Au niveau moléculaire, une série d’enzymes connues sous le nom de caspases sont en grande partie responsables de l’exécution de la voie de mort cellulaire apoptotique, mais pas nécrotique. En réponse à des signaux pro-apoptotiques, les caspases participent à une série de réactions qui aboutissent au clivage de substrats protéiques, provoquant le désassemblage de la cellule. Les caspases existent dans toutes les cellules de l’organisme sous forme de proenzymes dormantes. Au cours de l’apoptose, les caspases forment des molécules tétramères enzymatiques actives qui peuvent activer ou inactiver leurs substrats.

Ces enzymes reconnaissent spécifiquement une séquence de quatre ou cinq acides aminés sur le substrat cible, qui comprend un résidu d’acide aspartique comme cible de clivage. Les caspases fonctionnent dans d’autres processus biologiques, comme l’immunité ; en fait, de nombreux génomes viraux codent pour des inhibiteurs directs de ces caspases. Les caspases peuvent être détectées par des techniques d’immunoprécipitation ou d’immunoblotting en utilisant des anticorps spécifiques aux caspases, ou en utilisant des substrats fluorochromes qui deviennent fluorescents lors du clivage par la caspase. En outre, l’implication des caspases peut être visualisée en traitant des cultures vivantes avec un mimétique de Smac, un inducteur très puissant de l’apoptose.

Détection des mitochondries

Les mitochondries sont des régulateurs clés des processus de mort cellulaire tels que l’apoptose. On observe souvent, mais pas toujours, que la perte du potentiel transmembranaire interne mitochondrial est associée aux premiers stades de l’apoptose et on pense qu’elle joue un rôle dans la mort cellulaire indépendante de la caspase. Les tests basés sur la fluorescence conçus pour évaluer l’état fonctionnel des mitochondries sont des outils utiles pour examiner le rôle de l’activité mitochondriale dans la cascade de l’apoptose.

Phosphatidylsérine et annexine V

La phosphatidylsérine (PS), confinée au feuillet de la membrane interne des cellules viables, transloque vers la surface de la membrane exposée pendant les premiers stades de l’apoptose. Cet événement sert de signal d’attaque pour les cellules phagocytaires. La PS est exposée principalement au niveau des bulles de surface des cellules apoptotiques. L’annexine V a une forte affinité pour les membranes contenant le PS chargé négativement. Ces événements peuvent être visualisés à l’aide de la cytométrie en flux.

Cytométrie en flux

Les tests d’apoptose par cytométrie en flux ont maintenant presque 25 ans. Les premiers tests de cytométrie en flux pour l’apoptose analysaient les changements dans la diffusion avant et latérale et la fragmentation de l’ADN après un traitement à l’éthanol. Les tests de cytométrie en flux ciblent désormais presque toutes les étapes de l’apoptose, des premières modifications mitochondriales à l’activation des caspases, en passant par les modifications membranaires et les lésions de l’ADN. Contrairement aux essais antérieurs, la cytométrie en flux analyse l’apoptose dans des cellules individuelles.

La cytométrie en flux multiparamétrique est une approche idéale pour combiner plusieurs tests de mort cellulaire. La détection de la caspase FLICA, l’annexine V et un colorant de liaison à l’ADN impermanent aux cellules (par exemple, l’iodure de propidium) peuvent être combinés dans un test puissant et à plusieurs étapes pour l’apoptose (figure 1).

La combinaison de ces tests permet d’analyser la progression de l’apoptose et fournit une image beaucoup plus riche que n’importe quel test seul.

Une plateforme de cytométrie de flux de paillasse peut également fournir instantanément des informations cellulaires quantitatives pour de nombreuses analyses de santé cellulaire, de mort cellulaire, de signalisation cellulaire, d’immunologie et de cycle cellulaire. L’un de ces instruments utilise les principes de la cytométrie microcapillaire, qui permet d’analyser des échantillons de petite taille. La plateforme est fermée, c’est-à-dire que les réactifs et les logiciels sont étroitement associés pour des applications dédiées afin de simplifier le processus et de réduire la complexité analytique pour effectuer et obtenir des données basées sur la cytométrie.

La technologie permet l’analyse de deux marqueurs simultanément et peut être utilisée pour réaliser des études de cours temporel et de réponse à la dose, fournissant ainsi des connaissances plus approfondies sur les mécanismes en jeu ainsi qu’une image plus complète du processus de mort cellulaire (figure 2).

À ce jour, il n’existe qu’un seul test de cytométrie de flux disponible pour analyser l’autophagie, qui implique la mesure de la chaîne légère 3 (LC3). LC3 est une protéine qui se sépare en autophagosomes qui phagocytent les mitochondries défuntes et d’autres organelles intracellulaires et finalement en lysosomes. L’autophagie peut être détectée par cytométrie de flux en utilisant la translocation de la protéine fluorescente verte (GFP)-LC3 (figure 3).

Dans ce test, une lignée cellulaire est transfectée de manière stable avec la GFP-LC3. Pendant l’induction, un inhibiteur de lysozyme est ajouté pour bloquer la destruction des autophagosomes par les lysosomes. Si l’autophagie se produit, la GFP-LC3 s’accumule dans les autophagosomes en présence de l’inhibiteur et n’est pas libérée dans le milieu. Si l’autophagie ne se produit pas, la protéine GFP-LC3 s’accumule dans le cytoplasme et est libérée dans le milieu. La GFP-LC3 associée aux autophagosomes peut être détectée dans les cellules intactes par cytométrie de flux.

Cytométrie d’image

La cytométrie d’image permet de recueillir simultanément des données cytométriques et des images cellulaires corrélées, et de nombreuses options existent désormais pour ces types d’analyses. L’apoptose étant très variable et pléiotrope, l’imagerie peut permettre de vérifier que l’apoptose se produit et peut également caractériser le processus dans une certaine mesure par la visualisation de la condensation de la chromatine et de la dégradation du cytosquelette. La cytométrie d’image offre également des options d’analyse supplémentaires, notamment l’analyse pixel par pixel, qui sont utiles pour l’analyse apoptotique. En outre, il n’est pas nécessaire de détacher la trypsine ou l’Accutase®, qui peuvent « brouiller » les étiquettes apoptotiques.

La cytométrie d’image permet également d’analyser les cellules adhérentes sans retirer les cellules de leur substrat. Pour cette raison, de nombreux laboratoires utilisent la cytométrie d’image pour l’analyse des cellules apoptotiques adhérentes. Les cellules adhérentes qui sont arrachées de leur substrat, soit par grattage soit par la trypsine, peuvent perturber le phénotype apoptotique, voire induire le processus apoptotique lui-même. La cytométrie d’image permet aux cellules adhérentes de rester adhérentes tout au long de l’analyse en colorant les cellules directement sur la lame de la chambre. Il est important de noter que les cellules adhérentes s’arrondissent une fois qu’elles subissent l’apoptose, de sorte que certaines des cellules qui sont dans les dernières étapes de l’apoptose peuvent être perdues.

Un système de cytométrie d’image basé sur le flux fournit également une corrélation directe entre la cytométrie et l’imagerie, et combine ainsi l’analyse cytométrique et morphologique. Dans un système d’imagerie basé sur le flux, les cellules ne sont pas imagées sur une lame, mais directement dans le flux. Lorsque la cytométrie et l’imagerie sont corrélées, les cellules apoptotiques viables, de stade précoce, intermédiaire et tardif peuvent être classées et analysées (figure 4).

Conclusion – Mort cellulaire : Discriminer entre apoptose, nécrose &autophagie

La mort cellulaire est un processus naturel essentiel à de nombreuses fonctions physiologiques normales tant pour le développement que pour l’homéostasie. De plus, les altérations des voies de signalisation de la mort cellulaire sont associées à diverses maladies. La mesure des caractéristiques individuelles des cellules mourantes n’est pas suffisante pour discriminer les différentes voies de mort cellulaire, qui incluent l’apoptose, la nécrose et l’autophagie ; au lieu de cela, une évaluation multiparamétrique est nécessaire, qui inclut des critères descriptifs et fonctionnels.

Les progrès récents de la technologie permettent désormais de mieux comprendre les marqueurs moléculaires et les changements cellulaires qui caractérisent chaque voie de mort cellulaire, et ont également rendu possible la réalisation de bon nombre de ces analyses en tant qu’expériences de routine sur banc. DDW

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Cet article a été initialement publié dans le numéro d’hiver 2014 de DDW

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Le Dr John Abrams est professeur de biologie cellulaire ; ses recherches examinent les réseaux moléculaires in vivo impliqués dans la régulation de la mort cellulaire et explorent les déterminants de l’organisation de la chromatine. Il a rejoint l’University of Texas Southwestern Medical Center en 1994 et est devenu président du programme d’études supérieures en génétique et développement en 2004. Le Dr Abrams a obtenu son doctorat à l’université de Stanford.

Le Dr William G. Telford est devenu un scientifique du personnel de l’Institut national du cancer dans les Instituts nationaux de la santé en 1999, et est le directeur du laboratoire central de cytométrie en flux dans la branche de la transplantation expérimentale et de l’immunologie du NCI. Il a obtenu un doctorat en microbiologie à l’Université d’État du Michigan et a suivi une formation postdoctorale en immunologie à la faculté de médecine de l’Université du Michigan.

Louise Rollins est chef de produit chez EMD Millipore Corporation où elle soutient le développement du Muse® Cell Analyzer, un cytomètre en flux miniaturisé, ainsi que ses kits de dosage et modules logiciels spécifiques aux applications pour l’analyse de routine de la santé et de la mort cellulaire.