Les tests de concentration minimale inhibitrice (MIC) et de concentration minimale bactéricide (MBC) définissent la puissance d’un matériau d’essai en termes de concentration à laquelle il inhibera la croissance de (concentration minimale inhibitrice, ou CMI) ou tuer complètement (concentration bactéricide minimale, ou CMB) 1 x 106 (un million) de micro-organismes de défi pendant une période de 18 à 20 heures d’exposition incubée (35 ± 2°C).
La méthode CMI mesure l’effet de concentrations décroissantes d’antiseptique sur une période de temps définie en termes d’inhibition de la croissance de la population microbienne. La concentration de médicament nécessaire pour produire l’effet est définie comme la concentration minimale inhibitrice, et est normalement plusieurs centaines à milliers de fois inférieure à la concentration trouvée dans la forme posologique finie.
Méthodes pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens en dilution pour les bactéries à croissance aérobie
La référence standard utilisée comme base pour effectuer la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est la version la plus récente des méthodes pour les tests de sensibilité aux antimicrobiens en dilution pour les bactéries à croissance aérobie (actuellement, CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) ou anaérobie (CLSI Doc. M11-A8).
MIC &Vue d’ensemble du test MBC
Le produit est dilué en série 1:2 dans un milieu de croissance adapté pour favoriser la croissance de chaque microorganisme de provocation, généralement un bouillon Mueller-Hinton (MHB) ou une gélose Mueller-Hinton (MHA), pour produire une série de dilution du produit dans le milieu jusqu’à 1:32 768 (selon BSLI SOP L-2045). Toutefois, selon le type de produit, la série de dilution peut ne pas être effectuée jusqu’à ce point. Aux tubes de la série contenant chacun une aliquote de 2,0 mL du produit dilué en série dans le milieu de croissance, on ajoute maintenant 1,0 mL d’une suspension de 1 x 106 UFC/mL d’une espèce de défi. Après les 18 à 24 heures d’exposition en incubation, les tubes contenant la suspension de micro-organisme/produit/milieu de provocation sont examinés pour déterminer la plus haute dilution du produit (et inversement, la plus faible concentration du produit) qui inhibe complètement la croissance du micro-organisme, telle que déterminée à l’œil nu. Cette valeur de dilution (et/ou de concentration du produit) est enregistrée comme la valeur de la concentration minimale inhibitrice.
Si une détermination de la CBM est souhaitée, des quantités mesurées sont transférées de la suspension de dilution qui représente la concentration minimale inhibitrice, et des deux ou trois suspensions de dilution précédant la dilution de concentration minimale inhibitrice, sur des plaques de milieu de croissance solide, qui sont ensuite incubées pendant 24 heures à 37E± 2E. Après incubation, les plaques sont examinées pour vérifier la croissance du micro-organisme de provocation. La dilution du produit (et/ou la concentration du produit) qui ne produit aucune croissance est enregistrée comme étant la CMI. Il est à noter que les procédures de test CMI/CMB peuvent être effectuées en utilisant des dilutions sérielles 1:2 du produit dans un milieu de gélose nutritive (test en phase solide) ou en utilisant des dilutions sérielles 1:2 du produit dans un milieu de bouillon nutritif (test en phase de suspension). À moins que le commanditaire n’exige spécifiquement la méthode de dilution en gélose, BSLI effectuera le test CMI en utilisant la méthode de dilution en bouillon en macrotube, car elle est beaucoup moins gourmande en matériel et en temps.
Produits testés dans le cadre d’une drogue nouvelle expérimentale
Pour les produits qui doivent être testés dans le cadre d’une IND, la FDA précise clairement à la page 31444 du TFM quels micro-organismes doivent être utilisés pour tester les produits in vitro. Pour l’étude de la concentration minimale inhibitrice, le TFM indique que le produit fini, le principe actif du produit et le véhicule du produit doivent chacun être confrontés à 25 souches ATCC et 25 souches fraîches isolées cliniquement de chacune des 12 espèces bactériennes Gram-négatives et 11 espèces bactériennes Gram-positives et des deux groupes d’espèces de levures (Candida albicans et Candida spp., pas albicans). Il s’agit donc d’une étude de très grande envergure qui consiste à tester 1 250 souches des 25 bactéries et levures totales qui sont spécifiées dans le TFM par rapport à chacune des trois configurations de produits.
Ces dernières années, la FDA a quelque peu reculé par rapport à cette exigence onéreuse – bien que le produit fini doive être testé par rapport aux 1 250 souches, comme indiqué, le principe actif du produit et le véhicule du produit doivent seulement être confrontés à cinq souches ATCC et cinq souches fraîches isolées cliniquement de chacune des 25 espèces de bactéries/levures. Malgré cela, 250 souches au total doivent être testées pour le principe actif et le véhicule, et l’étude TFM MIC globale est assez massive et coûteuse – au total, 1 750 déterminations individuelles de la concentration minimale inhibitrice. La FDA autorise également certaines substitutions d’espèces (par exemple, des espèces de Bacteroides autres que B. fragilis, et des espèces de Staphylocoques à coagulase négative autres que S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus et S. saprophyticus) pour pallier la rareté des souches ATCC et/ou des isolats cliniques de certaines des espèces requises par le TFM. Et, reconnaissant qu’en général, les alcools ne sont pas actifs sur le plan antimicrobien après environ deux dilutions de 1:2, la FDA n’exige pas de données CMI pour les produits dans lesquels un alcool est le seul composant actif.
CMI & MBC Preuve de concept à des fins de marketing
Bien que BSLI ait réalisé plusieurs des études complètes de concentration minimale inhibitrice requises par le TFM pour les produits enregistrés comme IND, la majorité des études de concentration minimale inhibitrice et des études MBC occasionnelles sont réalisées pour la preuve de concept et à des fins de marketing. Dans ce type d’études, BSLI recommande généralement à ses clients de tester des souches ATCC des 25 espèces/souches énumérées dans le TFM, plus un isolat clinique de chacune d’entre elles (soit un total de 50 souches de provocation).