3.53.4.3 Terapia con fagos sintéticos
Los bacteriófagos, o simplemente llamados fagos, han desempeñado un papel central en el desarrollo de la biología molecular, la genética bacteriana y han proporcionado las primeras herramientas para recombinar moléculas de ADN, como las enzimas de restricción y las ligasas. En la última década, el estudio de los mecanismos de resistencia de los fagos ha conducido al descubrimiento de una de las tecnologías más importantes para la SB desde la PCR; se trata de los sistemas de nucleasas CRISPR, que las bacterias y las arqueas desarrollaron como defensa adaptativa al ADN exógeno. La reciente identificación de otros numerosos sistemas antifágicos no caracterizados previamente puede proporcionar más tecnologías innovadoras para las aplicaciones de la SB.45 En este contexto histórico, es apropiado que la SB se aplique ahora a los fagos para perfeccionar su uso como agentes terapéuticos.
Los fagos fueron descubiertos de forma independiente por Frederik Twort y Félix D’Hérelle a principios del siglo XX46,47 y poco después se utilizaron como agentes antimicrobianos para tratar enfermedades infecciosas como el cólera y la peste. En Europa del Este, la terapia con fagos se convirtió en algo habitual y hasta hoy existen varios centros de tratamiento de renombre, por ejemplo, en Georgia y Polonia. En Occidente, tras algunos éxitos iniciales esporádicos, la terapia con fagos dejó de utilizarse a medida que se generalizaba la disponibilidad de antibióticos. Hoy en día, con el aumento de los patógenos resistentes a los antimicrobianos, inicialmente las denominadas cepas ESKAPE48 pero ahora un conjunto aún más amplio de patógenos49 que se prevé que provoquen más muertes que el cáncer para el año 2050, hay un interés renovado en la terapia de fagos.
El uso de fagos tiene varias ventajas sobre los antibióticos, principalmente el potencial de dirigirse a cepas específicas y, por tanto, dejar intacta la comunidad microbiana beneficiosa, y también la capacidad de superar la resistencia mediante el uso de cócteles de fagos complementarios, el «entrenamiento» de fagos en cepas de huéspedes seleccionadas o simplemente el aislamiento de nuevos fagos contra un patógeno. Por el contrario, hay varios obstáculos que superar y áreas de mejora para que la terapia con fagos se convierta en una medicina fiable y se adopte de forma generalizada en Occidente, como por ejemplo: ensayos clínicos sólidos con controles adecuados, reducción del tiempo de identificación de los fagos con el rango de huéspedes adecuado, superación de la resistencia a los fagos y de los mecanismos de exclusión de la cepa objetivo sin necesidad de cócteles complejos, elusión de las respuestas inmunitarias no deseadas a las partículas de fagos y contención de la transducción generalizada de genes de resistencia a los antibióticos o factores de virulencia bacteriana. Incluso en el caso de que se mate con éxito una cepa objetivo, la rápida lisis de un gran número de bacterias y la liberación concomitante de endotoxinas y superantígenos puede dar lugar a una fuerte respuesta infamatoria y a un resultado clínico desfavorable.
La organización altamente modular de los genomas de los fagos y el ensamblaje de la estructura del fago como módulos funcionales, como las fibras de la cola, los picos, los tubos de la cola y la cápside, hace que los fagos sean objetivos ideales para los enfoques de SB, en cierto sentido los genomas de los fagos ya están organizados en BioBricks. En una plantilla temprana para el futuro diseño de fagos sintéticos, el fago filamentoso Pf3 se modificó para tratar la infección por Pseudomonas aeruginosa en un modelo de ratón.50 Se sustituyó un gen de la proteína de exportación de Pf3 por un gen que codifica la endonucleasa de restricción BglII, con el razonamiento de que (1) esta sustitución genética hace que Pf3 no se replique, introduciendo así una estrategia de contención, (2) el fago puede propagarse de forma estable en un huésped que contenga el gen de la metilasa BglII y (3) el BglII catalizaría roturas de doble cadena en el ADN genómico de la cepa objetivo para su eliminación. Un hallazgo importante de este estudio fue que el tratamiento de ratones infectados con el fago diseñado Pf3R o con un fago lítico dio una supervivencia comparable para los ratones desafiados con una dosis letal mínima de 3, pero a una dosis letal mínima de 5 la tasa de supervivencia fue significativamente mejor con la terapia de fago Pf3R. El análisis de los niveles de citoquinas en suero indicó una respuesta inflamatoria reducida, lo que indica que el mejor resultado para el grupo de tratamiento con Pf3R se debe a la eliminación eficiente de la cepa objetivo sin lisis ni liberación de endotoxinas.
La eliminación de P. aeruginosa por Pf3R se basa en el rango de hospedaje del fago para proporcionar especificidad de la selección, ya que se espera que los sitios de restricción de BglII estén presentes en prácticamente todos los genomas bacterianos. El notable descubrimiento de un bacteriófago que ha obtenido un sistema CRISPR/Cas, de una fuente desconocida, para su propio uso sugiere una mejora.51 El sistema CRISPR/Cas codificado por el fago es capaz de adquirir nuevos espaciadores y la nucleasa CAS3 ha sido reorientada a un elemento cromosómico que su huésped, Vibrio cholera, utiliza para la inmunidad innata. A raíz de este descubrimiento, el sistema CRISPR de tipo II de Streptococcus pyogenes fue diseñado en el bacteriófago M13 con espaciadores para apuntar a las secuencias de resistencia a los antibióticos y a los genes de virulencia en Escherichia coli, y los autores se refieren a estos dispositivos como nucleasas guiadas por ARN (RGN).52 Demostrando la exquisita especificidad de este sistema, una RGN fue capaz de matar de forma discriminatoria una cepa que albergaba un polimorfismo de un solo nucleótido en la ADN girasa que confiere resistencia a las quinolonas. Además, en un consorcio artificial de tres cepas bacterianas fueron capaces de matar a las cepas seleccionadas (entre 400 y 20.000 veces más que los controles) dejando intactos a otros miembros del consorcio. La especificidad de la matanza mediada por CRISPR/Cas podría ampliar la terapia con fagos más allá de la selección de patógenos para la modulación precisa de los microbiomas humanos, cuya composición se ha implicado en el pronóstico de algunos tipos de cáncer e incluso de trastornos neurológicos como el autismo, el Parkinson y el Alzheimer a través del eje intestino-cerebro.
Una plataforma ideal de fagos sintéticos podría ser aquella en la que la unión del rango del huésped se diseñe para que sea muy amplia, mientras que la especificidad de la selección de la cepa la proporciona la carga útil CRISPR/Cas. De este modo, los fagos podrían desplegarse fácilmente para los tratamientos, sin tener que aislar una nueva plataforma ad hoc para cada patógeno. Además, la amplia gama de huéspedes combinada con las matrices CRISPR dirigidas a varios genes de resistencia a los antibióticos o de virulencia podría permitir el uso de la terapia de fagos presuntiva, es decir, antes de la identificación del patógeno. Las estrategias de ampliación de la gama de hospedadores incluyen cribas genéticas para identificar los receptores de los fagos y los factores de hospedador necesarios,53 la extracción de secuencias de proteínas de unión a receptores (RBP) de profagos a partir de genomas bacterianos y el reinicio de fagos sintéticos que podrían, por ejemplo, codificar bibliotecas de proteínas de unión a receptores RBP para HTS.54,55 El enmascaramiento de los receptores por las cápsulas puede superarse expresando enzimas hidrolizadoras de exopolisacáridos56 y otras enzimas para degradar las biopelículas57 , mientras que otros mecanismos de enmascaramiento y la variación de fase en la expresión de los receptores pueden superarse mediante fagos diseñados con varias fibras de cola que contengan diferentes RBP o RBP a objetivos de la superficie celular no canónicos altamente conservados. Las bacterias despliegan numerosos sistemas antifágicos, siendo los principales la inmunidad innata de restricción-modificación y la inmunidad adaptativa de CRISPR/CAS, pero, a la inversa, los fagos han contraevolucionado múltiples estrategias para vencer estos sistemas, como el uso de nucleótidos no canónicos en su ADN, tener menos sitios de restricción o hipermetilar sus genomas y entregar proteínas que inhiben las enzimas de restricción o potencian las enzimas de metilación del huésped.
La plataforma de fagos sintéticos descrita aquí evitaría la necesidad de cócteles de fagos para los que la aprobación reglamentaria puede ser más compleja. Los objetivos restantes para la ingeniería de fagos son genéricos para muchos biológicos, como la estabilidad y la respuesta del sistema inmunitario. Las células fagocíticas, en particular, se encargan de eliminar las partículas de fago del sistema circulatorio. Se obtuvieron mutantes de fagos de larga circulación mediante una técnica de pases en serie58 y se descubrió que estaban mutados en la proteína principal de la cápside. Posteriormente, un cambio de un solo aminoácido, también en una proteína de la cápside, introducido mediante manipulación genética directa, dio lugar a un aumento de 13.000 a 16.000 veces en la capacidad del fago para permanecer en el sistema circulatorio del ratón.59 Otros parámetros para mejorar los fagos como agentes terapéuticos, como la producción, la formulación y la vía de administración, probablemente queden fuera del ámbito de las actividades de la SB, pero las lecciones aprendidas de los trabajos anteriores con fagos nativos también se aplicarán a los fagos diseñados por la SB.
Durante la última década, con el renovado interés en la terapia con fagos y los informes esporádicos de casos de pacientes individuales que han tenido éxito, se han realizado intentos de realizar ensayos clínicos controlados que no han dado lugar a efectos adversos significativos, pero la eficacia aún no se ha demostrado de forma rotunda. Será un próximo artículo emocionante de la historia de la terapia con fagos, que comenzó hace más de 100 años, ver cómo los fagos diseñados por SB entran en los ensayos clínicos.