La muerte celular es crucial para la correcta ejecución de los procesos normales y fisiopatológicos y es ubicua en los sistemas biológicos.
Las formas programadas de muerte celular son responsables de la producción de patrones morfológicos durante el desarrollo, de la selección negativa durante la inmunidad y de la «carrera armamentística» molecular que se produce entre los genes virales y los del huésped durante la infección, así como del daño tisular que se produce con los estresores ambientales, como las genotoxinas.
Las alteraciones dentro de estas vías de muerte celular pueden manifestarse como enfermedades, incluyendo el cáncer, los trastornos degenerativos y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La capacidad de las células tumorales para eludir la muerte celular programada es un rasgo distintivo de la mayoría de los tipos de cáncer.
En los últimos años ha quedado claro que la mera medición de los rasgos distintivos individuales de las células moribundas, como la fragmentación nuclear o la permeabilidad de la membrana, no es suficiente para discriminar entre las diferentes vías de muerte celular, que incluyen la apoptosis, la muerte celular autofágica y la necrosis.
Lo que se necesita es una evaluación multiparamétrica de la muerte celular que revele los acontecimientos mecánicos que ocurren «entre bastidores». Según las recomendaciones del Comité de Nomenclatura sobre la Muerte Celular de 2009, los procesos relacionados con la muerte celular (apoptosis, necrosis, autofagia) pueden clasificarse según el aspecto morfológico, los criterios enzimológicos, los aspectos funcionales y las características inmunológicas.
Muerte celular en varias formas
La apoptosis
La apoptosis se refiere a un programa de suicidio celular dirigido por genes. Una gran variedad de proteínas celulares, incluidos los receptores de la superficie celular, las proteasas y los componentes mitocondriales, regulan un delicado equilibrio entre la supervivencia celular y la muerte por apoptosis. Las mutaciones en estas proteínas pueden desequilibrar la balanza y provocar la supervivencia y proliferación incontrolada de las células tumorales. Por lo tanto, el descubrimiento de los mecanismos de apoptosis puede dar lugar a nuevas estrategias para explotar esta forma de muerte celular con fines terapéuticos.
La apoptosis va acompañada de una reducción del volumen celular, la condensación nuclear, la fragmentación del ADN, el sangrado de la membrana plasmática y el engullimiento por parte de los fagocitos. Además, la apoptosis suele implicar la permeabilización de la membrana mitocondrial, seguida de la activación de la cascada de caspasas; sin embargo, pueden activarse alternativamente proteasas no caspasas.
Necrosis
La necrosis se ha considerado históricamente como una forma pasiva de muerte celular. Sin embargo, datos recientes sugieren que la necrosis también puede ser una forma alternativa de muerte celular programada cuya activación puede tener consecuencias importantes, como inducir una respuesta inflamatoria. La necrosis y la apoptosis son muy distintas morfológicamente. La necrosis se acompaña de un aumento del volumen celular, hinchazón de los orgánulos, rotura de la membrana plasmática y pérdida del contenido intracelular.
En cuanto a la diferencia entre apoptosis y necrosis, los diversos métodos para distinguir entre la muerte celular apoptótica y la necrótica se basan en rasgos característicos que pueden visualizarse y/o medirse, como el tamaño de la célula, la fragmentación celular y la rotura del ADN.
Autofagia
La autofagia es un proceso degradativo homeostático altamente regulado en el que las células destruyen sus propios componentes a través de la maquinaria lisosomal y los reciclan. Este proceso está asociado a diversas enfermedades, como la enfermedad de Alzheimer, el envejecimiento, el cáncer y la enfermedad de Crohn. En algunos casos, el aumento de la autofagia contribuye a la muerte celular a través de una amplia interacción con las vías de señalización proapoptótica. La comprensión de la correlación entre la autofagia y la muerte celular apoptótica es el centro de una gran cantidad de investigaciones, especialmente en la biología de los tumores.
Autofagia vs Apoptosis
La muerte celular autofágica se define morfológicamente como la muerte celular que se produce en ausencia de condensación de la cromatina pero que va acompañada de una vacuolización masiva del citoplasma. A diferencia de la apoptosis, la autofagia está poco o nada relacionada con los fagocitos. Durante esta forma de muerte celular, el material citoplasmático es secuestrado dentro de los autofagosomas para su degradación por los lisosomas.
Ahora se sabe que existe una interacción entre las vías apoptótica y de autofagia, y los estudios han demostrado que BCL2, que es un importante regulador de la apoptosis, es también un importante regulador de la vía de la autofagia.
Los recientes avances en biología química, análisis de vías y citometría sofisticada han permitido profundizar en los marcadores moleculares y los cambios celulares que caracterizan cada vía de muerte celular. Además, la evolución de la tecnología también ha hecho posible realizar muchas de estas evaluaciones como experimentos rutinarios de banco, en línea con los análisis posteriores. En conjunto, estos avances han transformado el estudio de la muerte celular en la disección de redes de señalización matizadas que se integran en sistemas complejos.
Una de las características fundamentales de la muerte celular que la comunidad científica está tratando de diseccionar es el punto de no retorno a lo largo de estas vías matizadas. Hay puntos reversibles e irreversibles a lo largo de cada vía de señalización de la muerte celular y determinar dónde se encuentra el punto de transición dentro de varios contextos es de gran importancia desde el punto de vista de intentar intervenir en el proceso. Independientemente del tipo de muerte celular, una vez que la célula ha superado el punto de no retorno, la muerte no puede evitarse.
Analizar la muerte celular
Para diseccionar, caracterizar y diferenciar las distintas formas de muerte celular, se necesitan dos tipos de criterios: descriptivos (por ejemplo, de imagen) y funcionales (por ejemplo, de inhibición de vías). Por ejemplo, la fragmentación del ADN y la activación de la caspasa pueden ayudar a definir la apoptosis, pero estos análisis no son definitivos cuando se utilizan de forma aislada porque la apoptosis puede producirse sin fragmentación del ADN, y la activación de la caspasa también está vinculada a otros procesos biológicos.
Por lo tanto, la muerte celular debe medirse siempre utilizando múltiples métodos, preferiblemente en la misma muestra, combinando ensayos bioquímicos y morfológicos cuando sea posible. Hay una serie de tecnologías que pueden proporcionar información valiosa sobre las distintas vías de muerte celular, entre las que se incluyen la obtención de imágenes, el TUNEL, los ensayos basados en la inmunología, la citometría de flujo, la citometría basada en imágenes y las tecnologías para la obtención de imágenes de células adherentes. Sin embargo, hay algunos inconvenientes comunes e inherentes a los métodos actuales para investigar la muerte celular que pueden limitar su utilidad.
Por ejemplo, tecnologías como Western Blotting y ELISA no son capaces de proporcionar cambios específicos por célula, aunque son muy útiles para recoger información sobre el cambio total en el proceso. Ciertos métodos de obtención de imágenes pueden tener limitaciones en cuanto a si se cuenta un número equivalente de células entre muestra y muestra, o si se cuentan suficientes células, lo que podría afectar a la reproducibilidad y/o a la precisión de los resultados.
En el otro extremo, métodos como la citometría de flujo multiparamétrica o la citometría de imagen pueden ser muy potentes y proporcionar datos ricos en contenido para los análisis de la muerte celular, pero estos métodos también pueden tener limitaciones. Por ejemplo, el acceso a la instrumentación puede ser limitado, puede haber un requisito de gran experiencia y formación, y la asequibilidad puede ser un reto.
Hay una necesidad en la industria de metodologías fáciles de usar, asequibles y accesibles que puedan proporcionar de forma robusta, precisa y reproducible respuestas a preguntas comunes y cotidianas que los investigadores están investigando en la salud y la muerte celular. A continuación se describen métodos establecidos y emergentes para discriminar eficazmente entre apoptosis, necrosis y autofagia.
Imagen
La muerte celular es, en última instancia, un proceso morfológico y el estándar de oro para analizar este proceso es la visualización de las células. Cuando se observa la muerte celular en un cultivo, resulta muy evidente lo que está ocurriendo. Por ejemplo, durante la apoptosis, las células se redondean y parecen hervir («blebbing»). Existen múltiples enfoques para obtener imágenes de la muerte celular, como la simple visualización de las células en tiempo real en el cultivo, la tinción de las células con naranja de acridina (un colorante vital específico para las células apoptóticas), la tinción histológica del tejido fijado y la microscopía electrónica. También hay nuevas opciones disponibles en la citometría de imagen, como se describe más adelante.
Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL)
El procedimiento Terminal Deoxynucleotidal Transferase dUTP Nick End Labeling (TUNEL) es un método muy común para examinar la fragmentación del ADN que resulta de la apoptosis. El TUNEL etiqueta los extremos terminales del ADN que se escinden en la región espaciadora entre los nucleosomas de la cromatina, y estas roturas de la cadena de ADN se visualizan mediante microscopía de luz. Aunque el TUNEL es un ensayo muy eficaz para la apoptosis, una limitación importante de este enfoque es que el TUNEL detecta las células apoptóticas en la última fase del proceso.
Activación de caspasas
A nivel molecular, una serie de enzimas conocidas como caspasas son las principales responsables de ejecutar la vía de la muerte celular apoptótica, pero no la necrótica. En respuesta a las señales pro-apoptóticas, las caspasas participan en una serie de reacciones que dan lugar a la escisión de sustratos proteicos, provocando el desmantelamiento de la célula. Las caspasas existen en todas las células del cuerpo como proenzimas latentes. Durante la apoptosis, las caspasas forman moléculas tetrámero enzimáticas activas que pueden activar o inactivar sus sustratos.
Estas enzimas reconocen específicamente una secuencia de cuatro o cinco aminoácidos en el sustrato objetivo, que incluye un residuo de ácido aspártico como objetivo para la escisión. Las caspasas funcionan en otros procesos biológicos, como la inmunidad; de hecho, muchos genomas virales codifican para inhibidores directos de estas caspasas. Las caspasas pueden detectarse mediante técnicas de inmunoprecipitación o inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos para caspasas, o utilizando sustratos fluorocromos que se vuelven fluorescentes al ser escindidos por la caspasa. Además, la participación de las caspasas puede visualizarse tratando cultivos vivos con un mimético de Smac, un inductor muy potente de la apoptosis.
Detección mitocondrial
Las mitocondrias son reguladores clave de los procesos de muerte celular, como la apoptosis. La pérdida del potencial transmembrana interno mitocondrial se observa a menudo, aunque no siempre, asociada a las primeras etapas de la apoptosis y se cree que tiene un papel en la muerte celular independiente de las caspasas. Los ensayos basados en fluorescencia diseñados para evaluar el estado funcional de las mitocondrias son herramientas útiles para examinar el papel de la actividad mitocondrial en la cascada de la apoptosis.
Fosfatidilserina y anexina V
La fosfatidilserina (PS), confinada en la hoja de la membrana interna de las células viables, se transloca a la superficie de la membrana expuesta durante las primeras etapas de la apoptosis. Este evento sirve como señal para que las células fagocíticas ataquen. La PS se expone principalmente en las vesículas de la superficie de las células apoptóticas. La anexina V tiene una gran afinidad por las membranas que contienen el PS cargado negativamente. Estos acontecimientos pueden visualizarse mediante citometría de flujo.
Citometría de flujo
Los ensayos de citometría de flujo para la apoptosis tienen ya casi 25 años. Los primeros ensayos de citometría de flujo para la apoptosis analizaban los cambios en la dispersión frontal y lateral y la fragmentación del ADN tras el tratamiento con etanol. En la actualidad, los ensayos de citometría de flujo se centran en casi todas las fases de la apoptosis, desde los primeros cambios mitocondriales hasta la activación de las caspasas, los cambios en la membrana y los daños en el ADN. A diferencia de los ensayos anteriores, la citometría de flujo analiza la apoptosis en células individuales.
La citometría de flujo multiparamétrica es un enfoque ideal para combinar múltiples ensayos de muerte celular. La detección de caspasas FLICA, la anexina V y un colorante de unión al ADN celular (p. ej., yoduro de propidio) pueden combinarse en un potente ensayo de apoptosis de varias etapas (Figura 1).
La combinación de estos ensayos permite analizar la progresión de la apoptosis y proporciona una imagen mucho más rica que la que puede ofrecer un solo ensayo.
Una plataforma de citometría de flujo de sobremesa también puede proporcionar información celular cuantitativa de forma instantánea para muchos análisis de salud celular, muerte celular, señalización celular, inmunología y ciclo celular. Uno de estos instrumentos utiliza los principios de la citometría microcapilar, que permite analizar muestras de pequeño tamaño. La plataforma es cerrada, por lo que los reactivos y el software están estrechamente emparejados para aplicaciones dedicadas con el fin de simplificar el proceso y reducir la complejidad analítica para realizar y obtener datos basados en la citometría.
La tecnología permite el análisis de dos marcadores simultáneamente y puede utilizarse para realizar estudios de curso temporal y de respuesta a la dosis, proporcionando así una visión más profunda de los mecanismos en juego, así como una imagen más completa del proceso de muerte celular (Figura 2).
Hasta la fecha, sólo hay un ensayo de citometría de flujo disponible para analizar la autofagia, que implica la medición de la cadena ligera 3 (LC3). La LC3 es una proteína que se segrega a los autofagosomas que fagocitan las mitocondrias defectuosas y otros orgánulos intracelulares y finalmente a los lisosomas. La autofagia puede detectarse mediante citometría de flujo utilizando la translocación de la proteína verde fluorescente (GFP)-LC3 (Figura 3).
En este ensayo, una línea celular se transfecta de forma estable con GFP-LC3. Durante la inducción, se añade un inhibidor de lisozima para bloquear la destrucción de los autofagosomas por los lisosomas. Si se produce la autofagia, la GFP-LC3 se acumulará en los autofagosomas cuando el inhibidor esté presente y no se liberará en el medio. Si no se produce la autofagia, la GFP-LC3 se acumulará en el citoplasma y se liberará en el medio. La GFP-LC3 asociada a los autofagosomas puede detectarse en las células intactas mediante citometría de flujo.
Citometría de imagen
La citometría de imagen permite recoger simultáneamente datos citométricos e imágenes celulares correlacionadas, y actualmente existen muchas opciones para estos tipos de análisis. Dado que la apoptosis es muy variable y pleiotrópica, la imagen puede proporcionar la verificación de que la apoptosis se está produciendo y también puede caracterizar el proceso en cierta medida a través de la visualización de la condensación de la cromatina y la ruptura del citoesqueleto. La citometría de imagen también proporciona opciones de análisis adicionales, incluido el análisis píxel a píxel, que son útiles para el análisis apoptótico. Además, no es necesario el desprendimiento de tripsina o Accutase®, que puede «enturbiar» las etiquetas apoptóticas.
La citometría de imagen también permite el análisis de células adherentes sin necesidad de retirar las células de su sustrato. Por esta razón, muchos laboratorios utilizan la citometría de imagen para el análisis de células apoptóticas adherentes. Las células adherentes que se arrancan de su sustrato, ya sea por raspado o por tripsina, pueden alterar el fenotipo apoptótico, o incluso inducir el propio proceso apoptótico. La citometría de imagen permite que las células adherentes permanezcan adheridas durante todo el análisis, tiñendo las células directamente en el portaobjetos de la cámara. Es importante tener en cuenta que las células adherentes se redondearán una vez que se sometan a la apoptosis, por lo que algunas de las células que se encuentran en las últimas etapas de la apoptosis pueden perderse.
Un sistema de citometría de imagen basado en corrientes también proporciona una correlación directa entre la citometría y las imágenes, y por lo tanto combina el análisis citométrico y morfológico. En un sistema de imagen basado en el flujo, las células no se visualizan en un portaobjetos, sino que se visualizan directamente en el flujo. Cuando se correlacionan la citometría y las imágenes, se pueden separar y analizar las células apoptóticas viables, de fase temprana, intermedia y tardía (Figura 4).
Conclusión – Muerte celular: Discriminación entre apoptosis, necrosis & autofagia
La muerte celular es un proceso natural esencial para muchas funciones fisiológicas normales tanto para el desarrollo como para la homeostasis. Además, las alteraciones en las vías de señalización de la muerte celular están asociadas a diversas enfermedades. La medición de los distintivos individuales de las células moribundas no es suficiente para discriminar entre las diferentes vías de muerte celular, que incluyen la apoptosis, la necrosis y la autofagia; en su lugar, se necesita una evaluación multiparamétrica que incluya criterios tanto descriptivos como funcionales.
Los recientes avances tecnológicos permiten ahora profundizar en los marcadores moleculares y en los cambios celulares que caracterizan cada vía de muerte celular, y también han hecho posible llevar a cabo muchos de estos análisis como experimentos rutinarios de banco. DDW
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Este artículo apareció originalmente en el número de invierno de 2014 de DDW
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El Dr. John Abrams es profesor de biología celular; su investigación examina las redes moleculares in vivo implicadas en la regulación de la muerte celular y explora los determinantes de la organización de la cromatina. Se incorporó al Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas en 1994 y se convirtió en director del programa de posgrado en genética y desarrollo en 2004. El Dr. Abrams se doctoró en la Universidad de Stanford.
El Dr. William G. Telford se convirtió en científico de plantilla del Instituto Nacional del Cáncer en los Institutos Nacionales de la Salud en 1999, y es el director del laboratorio central de citometría de flujo en la Subdivisión de Inmunología y Trasplantes Experimentales del NCI. Se doctoró en microbiología en la Universidad Estatal de Michigan y completó su formación posdoctoral en inmunología en la Facultad de Medicina de la Universidad de Michigan.
Louise Rollins es directora de producto en EMD Millipore Corporation, donde apoya el desarrollo del Muse® Cell Analyzer, un citómetro de flujo miniaturizado y sus kits de ensayo de aplicación específica y módulos de software para el análisis rutinario de la salud y la muerte celular.