Las pruebas de Concentración Inhibitoria Mínima (MIC) y Concentración Bactericida Mínima (MBC) definen la potencia de un material de prueba en términos de la concentración a la que inhibirá el crecimiento de (Concentración Inhibitoria Mínima, o MIC) o mata completamente (Concentración Bactericida Mínima, o MBC) 1 x 106 (un millón) de microorganismos de desafío durante un período de 18 a 20 horas de exposición incubada (35 ± 2°C).
El método de la CIM mide el efecto de las concentraciones decrecientes de antiséptico durante un período de tiempo definido en términos de inhibición del crecimiento de la población microbiana. La concentración de fármaco necesaria para producir el efecto se define como la Concentración Inhibitoria Mínima, y normalmente es de varios cientos a miles de veces menor que la concentración encontrada en la forma farmacéutica acabada.
Métodos para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por dilución para bacterias que crecen aeróbicamente
La referencia estándar utilizada como base para realizar la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) es la versión más actual de Métodos para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por dilución para bacterias que crecen aeróbicamente (actualmente, CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) o anaeróbicamente (CLSI Doc. M11-A8).
MIC &Resumen de la prueba MBC
El producto se diluye en serie 1:2 en un medio de crecimiento adecuado para soportar el crecimiento de cada microorganismo de desafío, normalmente caldo Mueller-Hinton (MHB) o agar Mueller-Hinton (MHA), para producir una serie de dilución del producto en el medio hasta 1:32.768 (según BSLI SOP L-2045). Sin embargo, dependiendo del tipo de producto, la serie de dilución puede no llevarse a cabo hasta ese punto. A los tubos de la serie, cada uno de los cuales contiene una alícuota de 2,0 mL del producto diluido en serie en medio de crecimiento, se añade ahora 1,0 mL de una suspensión de 1 x 106 UFC/mL de una especie de desafío. Tras las 18 a 24 horas de exposición incubada, se examinan los tubos que contienen la suspensión de microorganismo/producto/medio de desafío para determinar la mayor dilución de producto (y, a la inversa, la menor concentración de producto) que inhibe por completo el crecimiento del microorganismo, según se determine a simple vista. Este valor de dilución (y/o valor de concentración de producto) se registra como valor de la Concentración Inhibitoria Mínima.
Si se desea una determinación de la CBM, se transfieren cantidades medidas de la suspensión de dilución que representa la Concentración Inhibitoria Mínima, y de las dos o tres suspensiones de dilución que preceden a la dilución de la Concentración Inhibitoria Mínima, a placas de medio de crecimiento sólido, que se incuban durante 24 horas a 37E± 2E. Tras la incubación, se examinan las placas para comprobar el crecimiento del microorganismo de desafío. La dilución del producto (y/o la concentración del producto) que no produce crecimiento se registra como el CMB. Obsérvese que los procedimientos de ensayo de MIC/MBC pueden realizarse utilizando diluciones seriadas 1:2 del producto en medio de agar nutritivo (ensayo en fase sólida) o utilizando diluciones seriadas 1:2 del producto en medio de caldo nutritivo (ensayo en fase de suspensión). A menos que el patrocinador requiera específicamente el método de dilución en agar, BSLI realizará las pruebas de CIM utilizando el método de dilución en caldo con macrotubo, porque es mucho menos intensivo en cuanto a materiales y tiempo.
Productos probados bajo un nuevo fármaco en investigación
Para los productos que deben ser probados bajo un IND, la FDA especifica claramente en la página 31444 del TFM qué microorganismos deben utilizarse para desafiar los productos in vitro. Para el estudio de la Concentración Inhibitoria Mínima, el TFM establece que el producto terminado, el principio activo del producto y el vehículo del producto deben ser desafiados cada uno con 25 cepas ATCC y 25 cepas frescas aisladas clínicamente de cada una de las 12 especies bacterianas Gram-negativas y 11 Gram-positivas y los dos grupos de especies de levadura (Candida albicans y Candida spp., no albicans). Se trata, por tanto, de un estudio muy amplio que implica el ensayo de 1.250 cepas del total de 25 bacterias y levaduras que se especifican en el TFM frente a cada una de las tres configuraciones del producto.
En los últimos años, la FDA ha reducido un poco este oneroso requisito -aunque el producto terminado debe someterse a pruebas frente a las 1.250 cepas, como se ha dicho, el principio activo del producto y el vehículo del producto sólo tienen que enfrentarse a cinco cepas del ATCC y a cinco cepas frescas aisladas clínicamente de cada una de las 25 especies de bacterias/levaduras. Aun así, esto hace un total de 250 cepas que deben ser probadas tanto para el activo como para el vehículo, y el estudio general de MIC de TFM es bastante masivo y costoso – en total, 1.750 determinaciones individuales de Concentración Mínima Inhibitoria. La FDA también permite algunas sustituciones de especies (por ejemplo, especies de Bacteroides distintas de B. fragilis, y especies de Staphylococcus coagulasa-negativos distintas de S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus y S. saprophyticus) para adaptarse a la escasez de cepas ATCC y/o de aislados clínicos de algunas de las especies requeridas por el TFM. Y, reconociendo que, en general, los alcoholes no son antimicrobianos después de unas dos diluciones 1:2, la FDA no exige datos de CIM para los productos en los que un alcohol es el único componente activo.
MIC &Prueba de concepto en fines de comercialización
Aunque BSLI ha realizado varios de los estudios completos de Concentración Inhibitoria Mínima exigidos por el TFM para los productos registrados en el IND, la mayoría de los estudios de Concentración Inhibitoria Mínima y ocasionalmente de MBC se realizan con fines de prueba de concepto y comercialización. En este tipo de estudios, el BSLI suele recomendar a los clientes que se prueben cepas ATCC de las 25 especies/cepas enumeradas en el TFM, más un aislado clínico de cada una de ellas (es decir, un total de 50 cepas de desafío).