Se describen los requisitos esenciales para los ensayos enzimáticos y se discuten los errores y escollos que se producen con frecuencia, así como su forma de evitarlos. Los principales factores que deben tenerse en cuenta para el ensayo de enzimas son la temperatura, el pH, la fuerza iónica y las concentraciones adecuadas de los componentes esenciales, como los sustratos y las enzimas. La estandarización de estos parámetros sería deseable, pero la diversidad de las características de las diferentes enzimas impide la unificación de las condiciones de ensayo. No obstante, muchas enzimas, especialmente las de origen mamífero, poseen un pH óptimo cercano al fisiológico de 7,5, y la temperatura corporal de unos 37 °C puede servir como temperatura de ensayo, aunque por razones experimentales se prefiere frecuentemente 25 °C. Pero en muchos casos, las características particulares de cada enzima dictan condiciones de ensayo especiales, que pueden desviarse considerablemente de las condiciones recomendadas.

Además, no pueden darse valores exactos para las concentraciones de los componentes del ensayo, como los sustratos y las enzimas, a menos que puedan establecerse reglas generales en función del grado relativo de saturación. Se discuten las reglas para realizar el ensayo enzimático, la manipulación adecuada, los aspectos metódicos, la preparación de las mezclas de ensayo y los blancos, la elección del tiempo de ensayo, y se dan sugerencias para evitar errores frecuentes y triviales. Se consideran las particularidades de los ensayos enzimáticos más complejos, incluyendo las reacciones reversibles y los ensayos acoplados.

Por último, se describe el tratamiento de los datos experimentales para estimar la actividad enzimática. Se presenta el procedimiento para determinar la velocidad inicial de la enzima y su transformación en unidades enzimáticas definidas, así como sugerencias para la documentación de los resultados.