3.53.4.3 Syntetisk fagterapi

Bakteriofager, eller helt enkelt fager, har spelat en central roll i utvecklingen av molekylärbiologin, bakteriegenetiken och har tillhandahållit de tidigaste verktygen för att rekombinera DNA-molekyler, t.ex. restriktionsenzymer och ligaser. Under det senaste decenniet har studiet av fagernas resistensmekanismer lett till upptäckten av en av de viktigaste teknikerna för SB sedan PCR, nämligen CRISPR-nukleassystemen, som bakterier och arkéer utvecklat som ett adaptivt försvar mot exogent DNA. Den senaste tidens identifiering av många andra tidigare okarakteriserade antifagsystem kan ge ytterligare banbrytande teknik för SB-tillämpningar.45 I detta historiska sammanhang är det därför passande att SB nu tillämpas på fager för att fullända deras användning som terapeutiska medel.

Fager upptäcktes oberoende av varandra av Frederik Twort och Félix D’Hérelle i början av 1900-talet46,47 och snart efteråt användes de som antimikrobiologiska medel för att behandla infektionssjukdomar som kolera och pest. I Östeuropa blev fagterapi vanligt förekommande och flera välrenommerade behandlingscentra finns än i dag, till exempel i Georgien och Polen. I västvärlden, efter några sporadiska inledande framgångar, bleknade fagterapin bort i takt med att antibiotika blev allmänt tillgängliga. I dag, med ökningen av antimikrobiellt resistenta patogener, ursprungligen de så kallade ESKAPE-stammarna48 men nu en ännu bredare uppsättning patogener49 som förutspås leda till fler dödsfall än cancer år 2050, finns det ett förnyat intresse för fagterapi.

Användningen av fager har flera fördelar jämfört med antibiotika, främst potentialen att rikta in sig på specifika stammar och därmed lämna det gynnsamma mikrobiella samhället intakt, och även möjligheten att övervinna resistens genom att använda kompletterande fagecocktails, ”träna” fager på utvalda värdstammar eller helt enkelt isolera nya fager mot en patogen. Omvänt finns det flera hinder som måste övervinnas och förbättringsområden för att fagterapi skall kunna bli ett tillförlitligt läkemedel och allmänt accepteras i västvärlden, t.ex. starka kliniska prövningar med ordentliga kontroller, förkortning av tiden för identifiering av fager med lämpligt värdområde, övervinnande av fageresistens och uteslutningsmekanismer hos målstammen utan att det behövs komplexa cocktails, kringgående av oönskade immunreaktioner på fagpartiklarna och begränsning av generaliserad överföring av gener för antibiotikaresistens eller virulensfaktorer hos bakterier. Även om man lyckas döda en målstam kan den snabba lyseringen av ett stort antal bakterier och den samtidiga frisättningen av endotoxiner och superantigener resultera i en stark inflammatorisk reaktion och ett ogynnsamt kliniskt utfall.

Den mycket modulära organiseringen av faggenomerna och sammansättningen av fagstrukturen som funktionella moduler, t.ex. svansfibrer, spikar, svansrör och kapsid, gör att fagerna är ideala måltavlor för SB-ansatser, på sätt och vis är faggenomerna redan organiserade i BioBricks. I en tidig mall för framtida syntetisk fagdesign modifierades den filamentösa fagen Pf3 för att behandla Pseudomonas aeruginosa-infektioner i en musmodell50 . En gen för exportprotein i Pf3 ersattes med en gen som kodar för restriktionsendonukleaset BglII, med resonemanget att 1) denna genersättning gör Pf3 icke-replikerande och därmed introducerar en inneslutningsstrategi, 2) fagen kan förökas stabilt i en värd som innehåller genen för BglII-metylas och 3) BglII skulle katalysera dubbelsträngsbrott i genomiskt DNA hos den målstam som ska dödas. Ett viktigt resultat av denna studie var att behandling av infekterade möss med den konstruerade fagen Pf3R eller med en lytisk fage gav jämförbar överlevnadsförmåga för möss som utsattes för en minsta dödlig dos på 3, men vid en minsta dödlig dos på 5 var överlevnadsfrekvensen betydligt bättre med behandling med fagen Pf3R. Analys av cytokinnivåer i serum visade på en minskad inflammatorisk reaktion, vilket tyder på att det bättre resultatet för Pf3R-behandlingsgruppen beror på att målstammen dödas effektivt utan lysis och frisättning av endotoxin.

Dödandet av P. aeruginosa med hjälp av Pf3R är beroende av fagens värddjurssortiment för att ge målspecificitet, eftersom BglII-restriktionsställen förväntas finnas i i stort sett alla bakteriegenom. En förbättring föreslås av den anmärkningsvärda upptäckten av en bakteriofag som har erhållit ett CRISPR/Cas-system från en okänd källa för eget bruk.51 Det fagkodade CRISPR/Cas-systemet kan förvärva nya spacers och CAS3-nukleaset har omriktats till ett kromosomalt element som dess värd Vibrio cholera använder för medfödd immunitet. Efter denna upptäckt har CRISPR-systemet av typ II från Streptococcus pyogenes konstruerats till M13-bakteriofag med spacers för att rikta in sig på sekvenser för antibiotikaresistens och virulensgener i Escherichia coli. Författarna kallar dessa anordningar för RNA-styrda nukleaser (RGNs).52 Som ett bevis på systemets utsökta specificitet kunde en RGN på ett diskriminerande sätt döda en stam som hade en polymorfism med en enda nukleotid i DNA-gyrase, som ger kinolonresistens. I ett artificiellt konsortium av tre bakteriestammar kunde de dessutom döda utvalda stammar (400-20 000 gånger dödande jämfört med kontroller) samtidigt som de lämnade andra konsortiemedlemmar intakta. Specificiteten hos CRISPR/Cas-medierad avdödning skulle kunna utvidga fagterapin bortom att rikta sig mot patogener till exakt modulering av människans mikrobiom, vars sammansättning har involverats i prognosen för vissa cancerformer och till och med neurologiska sjukdomar som autism, Parkinson och Alzheimers via tarm-hjärn-axeln.

En idealisk syntetisk fagplattform skulle kunna vara en plattform där värddjursbindningen konstrueras för att vara mycket bred samtidigt som specificiteten för stammarnas målinriktning tillhandahålls av CRISPR/Cas-nyttolasten. På detta sätt skulle fager lätt kunna användas för behandlingar, utan att en ny plattform måste isoleras ad hoc för varje patogen. Vidare skulle det breda värdspektrumet i kombination med CRISPR-arrayer som är inriktade på flera antibiotikaresistens- eller virulensgener kunna möjliggöra användning av presumtiv fagterapi, det vill säga före identifiering av patogenen. Strategier för att utvidga värdområdet omfattar bland annat framåtriktad genetisk screening för att identifiera fagreceptorer och nödvändiga värdfaktorer,53 utvinning av sekvenser av receptorbindande protein (RBP) från bakteriegenom och återuppstart av syntetiska fager som till exempel skulle kunna koda för receptorbindande protein RBP-bibliotek för HTS.54,55 Maskering av receptorer genom kapslar kan övervinnas genom att uttrycka exopolysackaridhydrolyserande enzymer56 och andra enzymer för att bryta ned biofilmer57 , medan andra maskeringsmekanismer och fasvariationer i receptoruttryck kan övervinnas genom fager som konstruerats med flera svansfibrer som innehåller olika RBP:er eller RBP:er till icke-kanoniska, högt bevarade mål på cellytan. Bakterier använder sig av många system mot fager, varav de viktigaste är den medfödda immuniteten i form av restriktionsmodifiering och den adaptiva immuniteten i form av CRISPR/CAS, men omvänt har fagerna också utvecklat flera strategier för att besegra dessa system, t.ex. genom att använda icke-kanoniska nukleotider i sitt DNA, ha färre restriktionsställen eller hypermetylering av sina genom och leverera proteiner som hämmar restriktionsenzymer eller förstärker värdens metylerande enzymer.

Den syntetiska fageplattformen som beskrivs här skulle göra det möjligt att undvika behovet av fagecocktails för vilka det kan vara mer komplicerat att få ett myndighetsgodkännande. Återstående mål för fagteknik är generiska för många biologiska läkemedel, t.ex. immunförsvarets stabilitet och respons. Det är framför allt fagocytiska celler som ansvarar för att rensa bort fagpartiklar från cirkulationssystemet. Mutanter av fager som cirkulerar länge har erhållits med hjälp av en teknik med seriell passage58 och visade sig vara muterade i det stora kapsidproteinet. Senare ledde en enda aminosyraförändring, också i ett kapsidprotein, som infördes genom direkt genetisk manipulation, till en 13 000-16 000 gånger ökad kapacitet för fagen att stanna kvar i musens cirkulationssystem59 . Andra parametrar för att förbättra fager som terapeutiska medel, t.ex. produktion, formulering och administreringsväg, faller förmodligen utanför SB-verksamhetens räckvidd, men de lärdomar som dragits av tidigare arbete med infödda fager kommer också att gälla för SB-tillverkade fager.

Under det senaste decenniet, i och med det förnyade intresset för fagterapi och sporadiska rapporter om framgångsrika enskilda patientfall, har det gjorts försök att genomföra kontrollerade kliniska prövningar, vilket har resulterat i att det inte har uppstått några betydande biverkningar, men att effektiviteten fortfarande inte har kunnat visas på ett entydigt sätt. Det kommer att bli en spännande nästa artikel i historien om fagterapi, som började för över 100 år sedan, att se SB-tillverkade fager gå in i kliniska prövningar.