Egenskaper och detektion av botulinumneurotoxin

Clostridierna producerar fler typer av proteintoxiner än något annat släkte av mikroorganismer. Clostridium botulinums framstående egenskap är dess förmåga att syntetisera ett neurotoxin med extraordinär styrka. BoNT:er utgör en familj av farmakologiskt likartade toxiner som binder till perifera kolinerga synapser och blockerar acetylkolinexocytos vid neuromuskulära korsningar. BoNT:er produceras i livsmedel, i tarmen och i kultur som progenitor-toxinkomplex som består av botulint neurotoxin associerat med icke-toxiska proteiner. De icke-toxiska komponenterna i komplexen har visat sig ge neurotoxinet stabilitet och förhindra inaktivering av matsmältningsenzymer i tarmen.

Diagnosen av botulism ställs i allmänhet genom bedömning av kliniska symtom hos patienter och, vid livsmedelsburna utbrott, genom att man ser att det finns ett antal fall som involverar en grupp människor som har ätit ett gemensamt livsmedel. Vid de flesta undersökningar av botulism är det primära målet att påvisa förekomsten av BoNT eftersom sporer av C. botulinum är utbredda i miljön och kontaminerar många livsmedel. Påvisandet av BoNT i blod, maginnehåll och livsmedel bekräftar att det rör sig om botulism. Isolering av C. botulinum från ett misstänkt livsmedel, från avföring från spädbarn med botulismsymtom eller från sår ger stöd för diagnosen botulism. Det ger dock ingen bekräftelse i de flesta fall eftersom sporer finns i livsmedel och ibland i avföring från friska vuxna.

BoNT påvisas företrädesvis med hjälp av en bioassay av toxinet som extraherats från ett livsmedel eller kliniskt prov. Extraktet injiceras intraperitonealt i möss och djuren observeras regelbundet för att upptäcka typiska tecken på botulism i upp till fyra dagar. Beroende på hur mycket BoNT som finns närvarande observeras i allmänhet symtom på botulism inom 4-24 timmar. Karakteristiska symtom är minskad rörlighet hos djuren, pälsrynkor, andningssvårigheter, sammandragning av bukmusklerna som ger en ”geting”-morfologi, följt av konvulsioner och död. Djur som uppvisar dessa tecken dör vanligen inom 24-48 timmar. Djur som dör tidigare än 2 timmar eller efter 48 timmar bör anses ha fallit offer för andra substanser än BoNT. Dödsfall på grund av BoNT bekräftas genom neutralisering med serotypspecifika antitoxiner.

Komplikationer uppstår ofta vid bioassay av BoNT från kliniska prover och från vissa livsmedel på mus. Särskilt dödsfall orsakade av icke-botulinuminterfererande ämnen är vanliga. Dessa ospecifika dödsfall kan i allmänhet undvikas genom att späda ut den störande dödliga substansen till en slutpunkt där döden orsakas av den mer potenta BoNT. Ibland kan mer än en serotyp av BoNT finnas i ett prov som analyseras, och för att bekräfta detta krävs neutralisering med en blandning av antitoxiner. I livsmedel eller kliniska prover kan dödsfall som inte beror på botulinum inträffa på grund av infektion eller förekomst av endotoxiner. Infektionsämnen kan avlägsnas genom membranfiltrering eller genom tillsats av antibiotika till det testade extraktet. Extrakt som innehåller endotoxiner kan i allmänhet spädas ut till en lämplig slutpunkt, eller så kan endotoxinerna avlägsnas genom adsorption. Med extrakt från icke-proteolytiska stammar av C. botulinum (grupp II) ökar toxiciteten genom aktivering med ett proteas som trypsin. I vissa livsmedel kan trypsin generera toxiska peptider och därför bör reaktionen avslutas genom tillsats av trypsinhämmare från sojabönor efter 30-60 minuter.

Viabla C. botulinum kan isoleras från livsmedel genom anrikning i ett lämpligt tillväxtmedium, t.ex. buljong av kokt kött och glukos eller medier som innehåller peptoner, jästextrakt och glukos. C. botulinum har komplexa näringsbehov och kräver ett rikt medium för tillväxt. För isolering är det ofta lämpligt att värma en del av livsmedlet eller det kliniska provet till 80 °C eller 60 °C för att selektera för sporer av C. botulinum av grupp I respektive II. Ibland används 50 % etanol för att inaktivera vegetativa celler i livsmedelsprover som analyseras för C. botulinum grupp II. Efter anrikning testas förekomsten av BoNT med hjälp av en bioassay på möss enligt tidigare beskrivning. Selektiva isoleringsagar som innehåller antibiotika, bl.a. cikloserin, sulfametoxazol och trimetoprim, har använts för att isolera grupp I C. botulinum från kliniska prover.

En rad olika immunologiska metoder har utvecklats för att påvisa BoNT, men de flesta är inte lika känsliga som musbiotestet, och de har också den potentiella nackdelen att de påvisar biologiskt inaktiva BoNT. Flera framsteg inom enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) har gjorts för att lindra dessa nackdelar och det är troligt att ELISA kommer att användas för att komplettera men inte ersätta musbiotestet.