Minimum Inhibitory Concentration (MIC) och Minimum Bactericidal Concentration (MBC) testning definierar ett testmaterials styrka i termer av den koncentration vid vilken det hämmar tillväxten av (Minimum Inhibitory Concentration, eller MIC) eller helt dödar (Minimum Bactericidal Concentration, eller MBC) 1 x 106 (en miljon) utmanande mikroorganismer under en 18-20 timmars inkuberad exponeringsperiod (35 ± 2 °C).
Med MIC-metoden mäts effekten av minskande koncentrationer av antiseptika under en definierad tidsperiod i termer av hämning av mikrobiell populationstillväxt. Den koncentration av läkemedlet som krävs för att åstadkomma effekten definieras som den lägsta hämmande koncentrationen och är normalt flera hundra till tusentals gånger lägre än den koncentration som finns i den färdiga doseringsformen.
Methods For Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests For Bacteria That Grow Aerobically
Den standardreferens som används som grund för att utföra bestämningen av minsta hämmande koncentration (MIC) är den senaste versionen av Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically (för närvarande CLSI Doc. M7-A9, Clinical Laboratory Standards Institute ) eller anaerobt (CLSI Doc. M11-A8).
MIC & Översikt över MBC-testet
Produkten späds seriellt 1:2 i ett tillväxtmedium som är lämpligt för att stödja tillväxten av varje utmaningsmikroorganism, vanligen Mueller-Hinton Broth (MHB) eller Mueller-Hinton Agar (MHA), för att producera en utspädningsserie av produkten i mediet upp till 1:32,768 (enligt BSLI SOP L-2045). Beroende på produkttyp kan det dock hända att utspädningsserien inte utförs så långt. Till rören i serien som vart och ett innehåller en alikvot på 2,0 mL av produkten som spätts ut i tillväxtmedium tillsätts nu 1,0 mL av en 1 x 106 CFU/mL-suspension av en utmanande art. Efter 18-24 timmars inkuberad exponering undersöks de rör som innehåller suspensionen av utmaningsmikroorganism/produkt/medium för att fastställa den högsta utspädning av produkten (och omvänt den lägsta koncentrationen av produkten) som helt hämmar mikroorganismens tillväxt, vilket bestäms med blotta ögat. Detta utspädningsvärde (och/eller produktkoncentrationsvärde) registreras som värdet för minsta hämmande koncentration.
Om en MBC-bestämning önskas, överförs uppmätta mängder från den utspädningssuspension som representerar den lägsta hämmande koncentrationen och från de två eller tre utspädningssuspensioner som föregår utspädningen av den lägsta hämmande koncentrationen till plattor med fast tillväxtmedium, som sedan inkuberas i 24 timmar vid 37E± 2E. Efter inkuberingen undersöks plattorna för tillväxt av utmaningsmikroorganismen. Den utspädning av produkten (och/eller produktkoncentrationen) som inte ger någon tillväxt registreras som MBC. Observera att MIC/MBC-testförfaranden kan utföras med hjälp av 1:2 serieutspädningar av produkten i näringsagarmedium (testning i fast fas) eller med hjälp av 1:2 serieutspädningar av produkten i näringsbuljongmedium (testning i suspensionsfas). Om sponsorn inte specifikt kräver agarutspädningsmetoden kommer BSLI att utföra MIC-testningen med hjälp av makrotuberbuljongutspädningsmetoden, eftersom den är mycket mindre material- och tidskrävande.
Produkter som testas inom ramen för en prövning av ett nytt läkemedel
För produkter som måste testas inom ramen för en IND anger FDA tydligt på sidan 31444 i TFM vilka mikroorganismer som måste användas för att utmana produkterna in vitro. För studien av minsta hämmande koncentration anges i TFM att den färdiga produkten, produktens aktiva huvudämne och produktens vehikel var och en måste utmanas med 25 ATCC-stammar och 25 färska kliniskt isolerade stammar av var och en av de 12 gramnegativa och 11 grampositiva bakteriearterna och de två jästgrupperna av arter (Candida albicans och Candida spp., inte albicans). Det rör sig alltså om en mycket omfattande undersökning som omfattar testning av 1 250 stammar av de totalt 25 bakterier och jästsvampar som specificeras i TFM i förhållande till var och en av de tre produktkonfigurationerna.
Under de senaste åren har FDA dragit sig tillbaka något från detta betungande krav – även om den färdiga produkten måste testas mot de 1 250 stammarna, behöver produktens aktiva huvudämne och produktens vehikel enligt vad som anges endast prövas mot fem ATCC-stammar och fem färska kliniskt isolerade stammar av var och en av de 25 bakterie- och jästarterna. Trots detta är det totalt 250 stammar som måste testas för både den aktiva substansen och vätskan, och den totala TFM MIC-studien är ganska omfattande och dyr – totalt 1 750 individuella bestämningar av minsta hämmande koncentration. FDA tillåter också att vissa arter byts ut (t.ex. andra arter av Bacteroides än B. fragilis och andra arter av koagulasnegativa Staphylococcus än S. epidermidis, S. hominis, S. haemolyticus och S. saprophyticus) för att kompensera för bristen på ATCC-stammar och/eller kliniska isolat av vissa av de arter som krävs enligt TFM. FDA erkänner att alkoholer i allmänhet inte är antimikrobiellt aktiva efter två utspädningar i förhållandet 1:2 och kräver därför inte MIC-data för produkter där en alkohol är den enda aktiva komponenten.
MIC & MBC Proof of Concept in Marketing Purposes
Och även om BSLI har utfört flera av de fullständiga studier av lägsta hämmande koncentration som krävs enligt TFM för IND-registrerade produkter, utförs majoriteten av studierna av lägsta hämmande koncentration och enstaka MBC-studier i syfte att bevisa koncept och marknadsföring. I denna typ av studier rekommenderar BSLI i allmänhet att kunderna testar ATCC-stammar av alla 25 arter/stammar som förtecknas i TFM, plus ett kliniskt isolat av var och en av dem (dvs. totalt 50 utmanande stammar)
.