Kvinnans könsorgan hos nötkreatur. A) Livmodern (UT), äggstocken (OV) och äggledaren (OD) visas. B) Förstoring av det inringade området i figur 1A som visar trakten i detalj, där ampullan och den uterina tubusförbindelsen kan identifieras.

Gamete-Oviduct Interactions

Fertiliseringen äger rum i ett specialiserat område av äggledaren som kallas ampulla, där spermierna tränger in i de extracellulära ägghöljen (cumulusceller och zona pellucida). Ankomsten av oocyten och spermierna till ovidukten är inte alltid en synkroniserad händelse eftersom oocyten hos vissa arter (t.ex. hund) frigörs två eller tre dagar före befruktningen medan spermierna hos andra (t.ex. fladdermöss) finns i honans könsorgan upp till sex månader före ägglossningen (Holt, 2011). Följaktligen ger oviduktens miljö förmodligen en bra miljö för gameternas överlevnad och mognad.

Ovidukten kan utföra olika funktioner eftersom den har olika anatomiska regioner (figur 2) och en komplex oviduktad vätska som är dynamisk på grund av de förändringar som produceras under östralcykeln (Yañiz et al., 2006; Leese et al., 2008; Avilés et al., 2010). Denna komplexitet har nyligen börjat förstås tack vare utvecklingen av kraftfulla analysinstrument. Till exempel kan flera hundra proteiner (fläckar) identifieras när oviduktens vätska analyseras biokemiskt (figur 3). Användningen av tvådimensionell elektrofores ger kvalitativ och kvantitativ information om de olika proteiner (antal och volym av fläckar) som finns i oviductalvätskan. Denna typ av analys skulle kunna upptäcka subtila förändringar (dvs. fosforylering) i proteinerna beroende på brunstcykeln eller på grund av förekomsten av könsceller. Överraskande resultat inkluderar de förändringar som sker i oviduktens transkriptom på grund av närvaron av könsceller eller embryon (Fazeli et al., 2004; Georgiou et al., 2007; Almiñana et al., 2012). Ännu mer specifika förändringar observerades beroende på embryots utvecklingsstadium (embryo med fyra celler eller blastocyst), vilket ger en nedreglering av immunrelaterade gener som påverkar livmodern redan innan embryot anländer till detta organ (Almiñana et al., 2012). Dessutom upptäcktes förändringar även i närvaro av spermier med en X- eller Y-kromosom (Almiñana et al., 2014). Uttryck av gener (transkriptom) och proteiner (proteom) i äggledaren delas av flera arter, men de är inte identiska, vilket tyder på att vissa funktioner är bevarade; det verkar dock som om vissa andra specifika egenskaper är unika för varje art (Bauersachs et al., 2003, 2004; Tone et al., 2008; Mondéjar et al., 2012). Detta bör beaktas vid utvecklingen av specifika spädningsmedel och odlingsmedier för olika arter.

Gamfetskydd och överlevnad

Det har rapporterats att närvaron av oviduktad vätska har en positiv effekt på spermiernas livsduglighet (Killian, 2011) och att ovidukten tillhandahåller de näringsämnen som är nödvändiga för oocytens överlevnad och enzymer med en antioxidantverkan i oviduktad vätska (Leese et al, 2008; Avilés et al., 2010). Dessa enzymer är särskilt viktiga för spermierna eftersom de lätt skadas när de utsätts för reaktiva syrearter (ROS) som modifierar plasmamembranet (protein- och lipidperoxidation), vilket kan leda till DNA-brott (Aitken och Luliis, 2010). Dessutom betraktas spermier i kvinnans könsorgan som främmande celler, vilket påverkar spermiernas överlevnad på grund av den immunologiska övervakningen (Kawano et al., 2014). Hur denna process regleras återstår att klargöra, men vad som är otvivelaktigt är att den oviduktala miljön skyddar spermierna. Bevis som stödjer detta finns i det faktum att spermatozoer kan överleva i äggledaren från en eller två dagar när det gäller kor eller suggor upp till 6 mån när det gäller fladdermöss (Holt, 2011).

Oocytmognad i äggledaren

Det har rapporterats att oocytens livslängd i äggledaren är cirka 24 timmar hos människor, vilket är likadant för de flesta av de arter som hittills har analyserats. Hunden är dock speciell eftersom den oocyt som frigörs av äggstocken vid tidpunkten för ägglossning är omogen och behöver vistas mellan 2 och 3 d i ovidukten för att mogna före befruktning (Tsutsui et al., 2009). Hos vissa arter är effektiviteten vid in vitro-befruktning (IVF) fortfarande låg, främst på grund av otillräcklig standardisering av ART-tekniker (Mondéjar et al., 2012). Två hypoteser relaterade till oocytens mognad i ovidukten kan dock övervägas för att förklara skillnaderna mellan in vivo- och in vitro-effektiviteten vid befruktning: (i) De händelser som sker i ovidukten är inte grundläggande, men eftersom de inte inträffar under in vitro-förfaranden är det endast oocyter av högsta kvalitet som överlever. Detta skulle vara orsaken till den lägre procentuella andelen framgång vid ART jämfört med händelser in vivo. (ii) De oocyter som används vid in vitro-förfaranden är av lägre kvalitet än de som fysiologiskt sett ovuleras och befruktas i ovidukten, vilket resulterar i embryon med förändringar i icke vitala men viktiga egenskaper för deras hälsa under vuxenlivet, t.ex. epigenetiska märken (El Hajj och Haaf, 2013). Flera proteiner i oviduktens vätska kan binda till oocytens extracellulära hölje som kallas zona pellucida (ZP) och modifiera både dess protein- och kolhydratsammansättning. Sålunda visades att oviduktspecifikt glykoprotein (OVGP1), osteopontin, prostaglandin D-syntas av lipocalintyp och laktoferrin kan associeras med ZP hos olika arter (Goncalves, et al., 2008). OVGP1 är det mest studerade ZP-associerade proteinet, och dess roll i ZP-härdningen före befruktning som minskar polyspermier hos grisen har påvisats (Coy et al., 2008).

Flera mekanismer som deltar i sperma-ZP-bindningen och i den allmänna befruktningsprocessen (som reglerar möjligheten till polyspermier) moduleras av ovidukten. När det gäller ZP-härdning före befruktning visade en serie experiment med oocyter från nio arter och oviductalvätskor från fem arter att en kort inkubation av ovarieoocyten med oviductalvätska ger en tydlig förändring av ZP:s motståndskraft mot enzymspjälkning (Mondéjar et al., 2013). De erhållna resultaten var dock inte identiska, vilket tyder på en viss grad av specificitet som kan bero på i) olika proteinsammansättningar i oviductalvätskan eller till och med en annan proteinsekvens som kodas av den ortologa genen, vilket påvisats för OVGP1 (Avilés et al., 2010) eller ii) en annan sammansättning av ZP (protein och kolhydrater; Stetson et al., 2012). En del av skillnaderna mellan arter kan till och med bero på avsaknad av protein, vilket är fallet för OVGP1 hos häst och råtta. Hos hästen kan spermierna dessutom inte befrukta oocyten in vitro, men när oocyten inkuberas med oviduktad vätska från svin eller oviduktad protein DMBT1 ökar befruktningsgraden kraftigt (Ambruosi et al, 2013), vilket visar på betydelsen av ovidukten hos denna art.

Spermierna i ovidukten

Spermierna fäster sig vid oviduktens epitel i isthmusregionen. Denna bindning är ansvarig för bildandet av en spermiereservoar som väntar på tidpunkten för ägglossning. En sådan bindning är inte bara viktig för att upprätthålla spermiernas livsduglighet, utan också för att blockera för tidig kapacitering, vilket skulle äventyra eller till och med förhindra befruktning. Frigörandet av spermier från denna reservoar verkar medieras av olika faktorer, bland annat signaler som förmedlas av cumulus-oocytkomplexet (COC), oviduktala komponenter som modifierar spermiernas bindning och även förändringar i progesteron- och östradiolnivåerna och hyperaktivering av spermiernas motilitet (Suarez, 2006, 2008; Kölle m.fl, 2009; Talevi och Gualtieri, 2010; Coy et al., 2012).

De spermier som frigörs vid ejakulationen kan inte befrukta oocyten och måste vistas i den kvinnliga könsorganen innan de får kapacitet att slutföra befruktningsprocessen. De olika biologiska förändringar som spermierna genomgår i de kvinnliga könsorganen kallas kapacitering, en process som upptäcktes oberoende av Austin (1951) och Chang (1951) med kanin som djurmodell. Den detaljerade molekylära mekanism som är inblandad i denna process är ännu inte känd, främst på grund av att det är svårt att fastställa vad som verkligen händer i äggledaren. De förändringar som observeras hos spermier kan orsakas av omfördelning eller frisättning av proteiner, även om andra faktorer också kan vara inblandade (Yanagimachi, 1994; Florman och Ducibella, 2006). Det rapporterades att spermierna modifieras genom bindning av olika oviduktala proteiner (osteopontin och OVGP1), som i allmänhet ökar spermiernas livskraft, motilitet och kapacitering hos flera arter (Kan et al., 2006; Killian, 2011). OVGP1 kan alltså inte bara binda ZP och spermier utan också öka proteinfosforyleringen i spermier som är relaterad till spermiekapacitering (Kan et al., 2006). Andra mekanismer som är involverade i kapacitering av spermier från nötkreatur och svin är relaterade till närvaron av olika glykosidaser i oviduktens vätska (Carrasco et al., 2008) och i oviduktens epitelier (Ma et al., 2012). Dessutom beskrevs nyligen frisättning av sialidas från spermiernas plasmamembran under kapacitering (Ma et al., 2012). Dessa glykosidaser kan modulera spermiernas bindning till oviduktens epitel och följaktligen deras frisättning från spermiereservoaren. Mycket nyligen beskrevs för första gången förekomsten av en ny mekanism som ansvarar för specifika förändringar som förmedlas av små vesiklar (exosomer) under spermiernas transit genom äggledaren (Al-Dossary et al., 2013). Nyligen genomförda studier med hjälp av genetiskt modifierade möss har gett starka bevis för den kvinnliga könsorganens betydelse för spermiernas fertilitet (Kawano et al., 2010; Turunen et al., 2012). Sådana modifierade möss är subfertila eller kan inte befrukta oocyten med hjälp av IVF-teknik. Dessa genetiskt modifierade hanmöss är dock fertila in vivo. Man fann att deras spermier kan befrukta oocyten med hjälp av IVF-teknik när de inkuberas med livmodersekret, en process som kan förmedlas av exosomer, enligt beskrivningen ovan (Kawano et al., 2010). Sekret från de kvinnliga könsorganen skulle kunna användas för att förbättra spermiernas befruktningsförmåga in vitro när det gäller män med viktigt genetiskt värde men annars dålig fertilitet.

Gamete- och embryotransport i äggledaren

Gameter och embryon måste vara på rätt plats vid rätt tidpunkt; följaktligen bidrar äggledaren i hög grad till denna process. Spermierna måste nå oviduktens ampulla för att befrukta oocyten. Efter befruktningen ska zygoten och de tidiga embryona transporteras till livmodern för att möjliggöra implantation av blastocysten i endometriet (livmoderslemhinnan). Den involverade mekanismen är dock inte så enkel som förväntat.

Oocyt- och embryotransport

Oocyter och embryon är immotila. Oocyterna omges av ett stort antal celler (cumulusceller) vid tidpunkten för ägglossningen när de bildar en struktur som kallas cumulus oophorus, som fångas upp av infundibulum (figur 2). De har inte förmågan att röra sig på samma sätt som spermierna, utan måste transporteras passivt. Det har rapporterats att små förändringar i cumulus-expansionsnivån påverkar den initiala vidhäftningen av cumulus-oocytkomplexen till epitelet i infundibulum, vilket försvårar deras vidare transport (Suarez, 2006). Två viktiga komponenter är inblandade i transporten av oocyten till befruktningsplatsen: de samordnade sammandragningarna av de glatta muskelcellerna (myosalpinx eller muskelskiktet) längs oviduktens längd och epitelcellernas ciliära slag (figur 4). Om oviduktens kontraktioner förändras kommer oocyten inte att nå befruktningsplatsen hos möss (Dixon et al., 2009). Embryon och oocyter transporteras med olika hastighet i stoets och råttans äggledare (Suarez, 2006). Således är prostaglandin E2 som produceras av embryona inblandat i denna process. Nyligen rapporterades att embryon inducerar en förändring i oviduktens genuttryck och följaktligen kan modulera sin egen miljö (Almiñana et al., 2012).