Abstract

Minimala inhiberande koncentrationer (MIC) och minimala fungicidala koncentrationer (MFC) bestämdes för 38 oljor av vegetabiliskt ursprung mot Candida albicans. Fyra stammar inklusive en standardstam användes i denna studie. De svampdödande medlen flukonazol och amfotericin B användes som positiva kontroller. Den standardstam (ATCC10231) som användes i denna studie visade sig vara mycket resistent mot flukonazol: Det krävdes 3 000 μg ml-1 flukonazol för att delvis hämma tillväxten av denna stam, och fullständig hämning kunde inte uppnås. Andra Candida-stammar var känsliga för 5 μg ml-1 flukonazol. Alla stammar som användes var känsliga för amfotericin B. Av de 38 testade oljorna var 23 effektiva och 15 ineffektiva. På grundval av deras MFC-värden kategoriserades de effektiva oljorna i tre kategorier. Sju oljor, som utövade svampdödande effekt vid en koncentration av oljor på mindre än 0,15 %, grupperades i den mest effektiva klassen. De oljor som uppvisade MFC i intervallet 0,16-1,5 % koncentration betraktades som måttligt effektiva. Nio oljor som krävde mer än 1,5 % koncentration betraktades som mindre effektiva. Den flukonazolresistenta stammen (MTCC 227) var känslig för minst 23 av växtoljorna. Resultaten av denna studie tyder på att oljor av vegetabiliskt ursprung kan komma att användas som potentiella anti-Candida-medel.

1 Introduktion

Amphotericn B och Flukonazol är två viktiga medel som används i svampdödande kemoterapi mot humanpatogena svampar . Amfotericin B används som det bästa läkemedlet hos terminalt sjuka patienter . Azolläkemedlet flukonazol är allmänt förskrivet mot olika Candida albicans-infektioner . Även om dessa läkemedel är mycket välkända för sin effektivitet är de kända för att ha biverkningar . Flukonazol är fungistatiskt till sin natur och det finns rapporter om uppkomst av flukonazolresistens bland kliniska isolat av C. albicans. Det finns således ett behov av bättre, nya svampdödande medel mot infektioner orsakade av C. albicans som är effektiva och har mindre biverkningar.

Många naturliga medel som växtprodukter, inklusive extrakt, oljor etc., används traditionellt mot olika åkommor. Vissa av växtprodukterna är effektiva mot svamp- och bakterieinfektioner . Eteriska oljor som tea tree-olja, citrongräsolja, citronellaolja, palmaroshaolja och vissa av deras beståndsdelar har testats mot in vitro-tillväxt av C. albicans.

Vi har testat in vitro-effekten av 38 växtoljor mot fyra isolat av C. albicans. Minsta hämmande koncentrationer (MIC) och minsta fungicida koncentrationer (MFC) för de effektiva oljorna rapporteras. Baserat på deras effektivitet (MFC) klassificeras oljorna i tre kategorier.

2 Material och metoder

2.1 Kemikalier och stammar

En standardstam, typstam ATCC10231 (MTCC 227/CA IV), en referensstam som föreslagits för amfotericin B-analys, och tre kliniska isolat av C. albicans användes i denna studie. De tre kliniska isolaten av C. albicans, SRTCC I (CA I), SRTCC II (CA II) och SRTCC III (CA III), erhölls från SRTCC Culture Collection Center, School of Life Sciences, SRTM University, Nanded (MS). Indien. Standardstammen köptes från The Institute of Microbial Technology (IMTECH), Chandigarh, Indien.

Trettioåtta växtoljor användes i denna studie. Några av oljorna tillhandahölls vänligen av Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants (CIMAP), Lucknow, Indien, och de återstående oljorna och de svampdödande läkemedlen amfotericin B och flukonazol köptes från den lokala marknaden.

2.2 Beredning av inokula

Alla stammar av C. albicans som användes i den här studien odlades vid 30 °C i 24 timmar i en skakande inkubator med hjälp av Yeast Extract Peptone medium och Sabouraud Dextrose medium. Cellerna skördades genom centrifugering, suspenderades i sterilt destillerat vatten och användes omedelbart. Cellantalet bestämdes med hjälp av en hemocytometer och justerades till 5 × 106 cfu ml-1.

2.3 Screening av växtoljor för anti-Candida-aktivitet genom skivdiffusionsanalys

Den anti-Candida-aktiviteten hos 38 växtoljor testades med hjälp av standardskivdiffusionsanalys . Sabouraud Dextrose Agar-plattorna förbereddes och såddes med 5 × 106 cfu ml-1 med hjälp av inokula av Candida-stammar som förberetts enligt ovan. Aseptiskt drogs 5 μl växtoljor ut på 5 mm stora filterpappersskivor (Whatman nr 1). Dessa skivor fördes sedan över till mitten av de utsådda plattorna. Tre plattor användes för varje koncentration och inkuberades vid 30 ± 2 °C. Hämningszonens diameter mättes efter 48 timmars inkubation.

2.4 Bestämning av minsta hämmande koncentration (MIC) av växtoljor med hjälp av agarutspädningsmetoden

Minimala hämmande koncentrationer (MIC) av växtoljor bestämdes med hjälp av agarutspädningsmetoden.(23) Agarplattorna förbereddes genom att tillsätta YPD-agar som innehöll olika koncentrationer av växtoljor (dvs. 0,03-3 % v/v). Tween 20 0,5 % (v/v) tillsattes för att öka oljans löslighet. Dessa plattor inokulerades med 103 cfu med hjälp av de inokula av Candida-stammar som framställts enligt ovan. Plattorna förvarades i tre exemplar för varje koncentration. Plattor med Tween 20 men utan någon växtolja användes som kontroll. Alla dessa plattor inkuberades vid 30 ± 2 °C. Plattorna observerades och antalet kolonier räknades efter 48 timmars inkubation. MIC-värdena bestämdes som den lägsta koncentrationen av olja som förhindrar synlig tillväxt av Candida-stammar.

2.5 Bestämning av lägsta svampdödande koncentration (MFC) av växtoljor med hjälp av Broth makroutspädningsmetoden

Minsta svampdödande koncentration (MFC) av växtoljor bestämdes med hjälp av Broth makroutspädningsanalys (NCCLS M27-A, referensmetod som rekommenderas för testning av svampdödande mottaglighet hos jäst) . En rad olika koncentrationer (0,03-3 % v/v) av växtolja bereddes i YPD-buljongmedium i kolvar. Tween 80 inkluderades i en slutlig koncentration på 0,001 % (v/v) för att öka oljans löslighet. Varje kolv inokulerades med 5 × 105 cfu ml-1 av Candida-stammarna. Kolvar som innehöll Tween 20 men saknade växtolja användes som kontroll. Kolvarna inkuberades vid 30 ± 2 °C i en orbital skakinkubator (100 rpm) i 48 timmar. 5 μl kultur från varje kolv inokulerades på YPD-plattor och inkuberades vid 30 ± 2 °C i 48 timmar. Plattorna observerades och MFC bestämdes som den lägsta koncentrationen av växtoljan som helt hämmar tillväxten av Candida-stammar.

3 Resultat

3.1 Screening av växtoljor för anti-Candida-aktivitet

De isolat av C. albicans som testades visade olika känslighet för oljorna. Majoriteten av oljorna befanns dock vara effektiva och visade avsevärd aktivitet vid mycket låga koncentrationer. Tjugofem av de 38 testade oljorna orsakade en 1-30 mm zon av inhibition (ZOI). Sjutton oljor orsakade en ZOI på 10-20 mm. Sex oljor uppvisade en ZOI på 1-9 mm mot alla fyra testade stammar. Jasmin- och lavendelolja lyckades inte hämma tillväxten av Candida-stammarna utom CA IV. (Tabell 1). (13 oljor lyckades inte hämma tillväxten av C. albicans-stammarna vid 5-μl-doser.)

3.2 Bestämning av MIC för växtoljor mot C. albicans

MIC för de 23 effektiva oljorna och två allmänt förskrivna läkemedel, flukonazol och amfotericin B, bestämdes mot de fyra isolaten av C. albicans. Oljorna uppvisade koncentrationsberoende hämning av tillväxten. I några fall uppvisade de testade stammarna olika känslighet, men det fanns ingen betydande skillnad i MIC (tabell 2).

Alla fyra isolat visade sig vara känsliga för amfotericin B. En koncentration av amfotericin B på 2,5 μg ml-1 räckte för att hämma tillväxten av stam CAI och stam CA IV (ATCC10231) fullständigt. Stammarna CA II och CA III krävde 3 μg ml-1 amfotericin B för total tillväxthämning (tabell 2).

Svaret på flukonazol visade sig vara divergerande. Stammen Ca III var den känsligaste och endast 2 μg ml-1 koncentration av flukonazol var tillräcklig för fullständig tillväxthämning. Stammarna CA I och CA II krävde 5 μg ml-1 flukonazol () för fullständig tillväxthämning (tabell 2). Stam CA IV var mycket resistent mot flukonazol: Det krävdes 3 000 μg ml-1, dvs. 1 500 gånger MIC för stam CA III, för en partiell tillväxthämning. Fullständig tillväxthämning kunde inte uppnås hos denna stam ens vid en mycket hög koncentration.

En 0,01-procentig koncentration av kanelolja var tillräcklig för att fullständigt hämma tillväxten hos alla fyra isolaten. Jasmin- och lavendeloljor orsakade endast en liten tillväxthämning och lyckades inte hämma tillväxten helt. Sju oljor hämmade tillväxten av C. albicans-stammarna fullständigt vid koncentrationsintervallet 0,03-0,15 %. För 11 oljor varierade MIC från 0,16 % till 1,0 % Fem oljor krävde en koncentration på mer än 1,0 % (tabellerna 2 och 3).

3.3 Bestämning av MFC för växtoljor mot C. albicans

Minimal fungicidkoncentration (MFC) definieras som den lägsta koncentrationen av olja som resulterar i att 99,9 % av inokulumet dör. Alla oljor som hämmade tillväxten visade svampdödande aktivitet utom jasmin- och lavendeloljor. I allmänhet observerades att den fungicida koncentrationen var högre än MIC, utom i några få fall som t.ex. pepparmynts-, geranium-, ocimum-, kryddnejlika- och gingergräsoljor, som ledde till att 99,9 % av inokulumet dog vid MIC. Enligt deras MFC mot ATCC10231 kunde de effektiva oljorna klassificeras i tre klasser. De oljor som orsakade svampdödande effekt vid en koncentration på 0,03-0,15 % anses vara de mest effektiva (ME). Oljor som kräver 0,15-1,0 % koncentration ingår i den måttligt effektiva gruppen (MoE). De som befanns fungicida vid en koncentration på mer än 1,0 % anses vara mindre effektiva (LE).

Sju oljor befanns vara mest effektiva (ME) (tabellerna 2 och 3). Kanelolja var bäst och hade fungicid effekt vid 0,03 % koncentration på alla fyra isolaten av C. albicans. Kryddnejlikaolja var fungicid vid 0,12 % koncentration och det fanns ingen skillnad mellan MIC och MFC. För majoriteten av ME-oljorna krävdes 2-4 gånger MIC för fungicid effekt. Svaret från Candida-isolat på vissa medlemmar i denna grupp var avvikande, dvs. från stam CA II när det gäller japansk myntaolja och ingefärsolja, CA III när det gäller citrongräsolja och CA IV när det gäller ingefärsolja (tabell 2).

Pepparmynta- och teeträdolja var bäst bland gruppen av sju ME-medlemmar och orsakade svampdödande effekt vid en koncentration på 0,25 % (tabell 3). Tulsiolja var fungicid vid 0,5 % koncentration, 1 % var MFC för kamfer-, citron-, ocimum- och ylang-ylangoljor. Känslighetsskillnader för några medlemmar av denna grupp konstaterades också. Två gånger MIC krävdes för dessa oljor utom för pepparmynts- och ocimumolja (tabell 2).

Nio oljor visade sig vara mindre effektiva (tabell 3). Dessa oljor krävde mer än 1,0 % för att utöva en fungicid effekt. MFC för dessa oljor varierade från 1,0 % till 3 % utom för jasmin-, ingefära- och enbärsolja, som inte var fungicida upp till 3 % koncentration. CA II och CA III visade olika känslighet (tabell 2 och 3).

4 Diskussion

Anti-Candida-aktivitet hos vissa av de eteriska oljorna, t.ex. tea tree-olja, är välkänd . Många av de preparat som används mot vaginal candidiasis orsakad av C. albicans innehåller Tea tree oil som en aktiv komponent . Flera oljor av vegetabiliskt ursprung har föreslagits i alternativa läkemedel mot mikrobiella infektioner, inklusive candidiasis och gingivit . Azolantifungella medel och derivat fortsätter dock att dominera som de vanligaste läkemedlen mot Candida-infektioner, både som topikala tillämpningar och som orala läkemedel . Med undantag för tea tree-olja, som används sedan mer än 80 år tillbaka i Australien, har inte många växtbaserade produkter kommit ut på marknaden . Vissa produkter som innehåller rosmarinolja används mot svampar som orsakar mjäll . In vitro har eteriska oljor som Tea tree, citrongräs, citronella, pepparmynta och palmarosa rapporterats vara verksamma mot Candida. Vi har undersökt effekten av 38 oljor av vegetabiliskt ursprung för anti-Candida-aktivitet in vitro mot fyra isolat av C. albicans (tabellerna 1 och 2). Minst 23 av de testade oljorna visade sig vara lovande som effektiva medel. Dessa oljor kunde klassificeras enligt deras effektivitet (tabell 3). Ett av isolaten som visade sig vara resistent mot flukonazol inhiberades vid mycket låga koncentrationer av alla effektiva oljor av vegetabiliskt ursprung som testades i den här studien (tabell 2).

Disc diffusion assay är en standardmetod som ofta används för snabb screening av naturprodukter för svampdödande aktivitet . Vi har screenat växtoljor med hjälp av denna mycket bekväma analysmetod. Denna studie visar att försiktighet krävs eftersom olika oljor kan ha olika diffusionshastighet på agarplattor och detta kan bidra till variation i de hämmande zonerna, vilket leder till felaktiga slutsatser om deras svampdödande aktivitet. Vissa av oljorna som uppvisade mindre hämmande zoner jämfört med andra var till exempel mycket effektiva mot Candida-stammar i NCCLS:s buljongutspädningsanalys som inte inbegriper diffusion. Kanelolja uppvisade t.ex. en ZOI på 24 mm i skivdiffusionsanalysen, medan citrongräsolja uppvisade 30 mm. Men i MFC-analysen visade sig kanelolja (0,01 %) vara bättre än citrongräsolja (0,06 %). Svampdödande aktivitet anses vara en önskvärd egenskap hos svampdödande medel, eftersom den helt kan eliminera svampen från vävnaderna. Amfotericin B är svampdödande, är känd för att vara mycket effektiv mot humanpatogena svampar och används som förstahandsval vid systemiska svampinfektioner, trots dess allvarliga biverkningar . Flukonazol, som är det vanligaste svampmedlet mot Candida-infektioner, är fungistatiskt till sin natur och kan kräva långvarig användning .

Det är uppmuntrande att notera att majoriteten av de oljor som användes i den här studien var svampdödande vid låga koncentrationer. Det finns inte mycket information om verkningsmekanismen hos de naturprodukter som hämmar Candida-tillväxten. Fler flukonazol/azol-resistenta stammar måste inkluderas i framtida studier. Växtoljorna skulle kunna användas som anti-Candida-medel mot azolresistenta stammar. De flesta av de oljor som användes i denna studie har en lång historia av användning i livsmedel, konfektyr och som komponenter i parfymer. Om de ska övervägas i topiska preparat måste dock en noggrann undersökning av deras troliga irriterande och andra oönskade effekter på människor genomföras.

Acknowledgements

Författarna är tacksamma mot Dr. S.A. Suryawanshi, Hon’ble Vice Chancellor, SRTM University, Nanded (MS) India, för uppmuntran.