Diskussion
I den här studien visade vi att MR och GR finns i råttans binjurebark. Vi visade att förändrad MR-aktivitet reglerar aldosteronproduktionen i ZG på ett sätt som passar en negativ återkopplingsmekanism. Denna effekt är specifik för MR, eftersom modulering av aktiviteten hos GR i ZG inte hade någon effekt på aldosteronproduktionen. Såvitt vi vet är detta första gången som MR-uttryck och dess roll i regleringen av aldosteronutsöndringen i binjurebarken har rapporterats. I ZF/ZR observerade vi en liknande återkopplingsslinga när vi farmakologiskt modifierade GR-aktiviteten. Intressant nog undertryckte MR-aktivering också kortikosteronutsöndringen i ZF/ZR-celler. Våra resultat stämmer överens med tidigare studier som visar att glukokortikoidsyntesen i binjuren kan moduleras av steroider som syntetiseras i binjurebarken (Baird et al. 1983, Carsia & Malamed 1983, Darbeida & Durand 1987).
MR-aktivering med FLUDRO utövade en negativ effekt på aldosteronproduktionen i ZG-celler preparerade från råttor som underhålls med både HS- och LS-diet, medan canrenonsyra, en MR-antagonist, positivt reglerade steroidogenesen med en ökning av aldosteronutsöndringen i ZG-celler från LS-matade råttor. Vi såg ett mer uttalat svar i LS-grupperna jämfört med HS-grupperna. Avsaknaden av effekt av en GR-agonist och -antagonist på basal och stimulerad aldosteronfrisättning från ZG-cellerna tyder i hög grad på att den reglerande återkopplingsslingan är receptorspecifik.
Vad kan vara den fysiologiska och kliniska betydelsen av en ultrakort återkopplingsslinga för aldosteron? Det finns ett nära samband mellan aldosteronproduktion och miljöfaktorer, t.ex. natrium- och kaliumintag, hållning, tid på dygnet och volymförlust. Det har länge varit känt att olämpliga nivåer av aldosteron, för nivån på dessa miljöfaktorer, leder till en rad olika kardiovaskulära och metabola sjukdomar hos människor och andra djur. Därför är kritiskt känsliga negativa återkopplingsslingor viktiga för upprätthållandet av normal homeostas. Detta är särskilt relevant för volym/natriumhomeostas, eftersom till och med en liten felanpassning av reaktionerna på förändringar i det miljömässiga natriumintaget över tid kan leda till betydande negativa kardiovaskulära effekter. Dessa potentiella konsekvenser är sannolikt anledningen till att det finns flera kontroller och balanser i de system som reglerar volym/natriumhomeostasen, t.ex. renin-angiotensinsystemet, aldosteron, natriuretiska peptider, endotelin, vasopressin och njuren (njurblodflöde, proximala tubuli, Henle-slingan och distala tubuli/samlingsröret). Dessa reglerande faktorer styrs delvis av: (1) ”långa” negativa återkopplingsslingor, t.ex. negativ återkopplingsslinga mellan volym, renin, angiotensin och aldosteron, (2) verkningsriktningen hos motverkande faktorer, t.ex. natriuretiska peptider som undertrycker aldosteronutsöndringen och (3) ultrakorta återkopplingsslingor, t.ex. direkt undertryckande av reninfrisättning från juxtaglomerulärapparaten genom angiotensin II:s interaktion med angiotensinreceptor typ 1. I vissa avseenden är ultrakorta återkopplingsslingors funktioner analoga med det nästan universella begreppet produktinhibering av enzymfunktion. Parallellt med angiotensin II:s effekt stöder den aktuella studien hypotesen att det också finns en ultrakort återkopplingsslinga som modifierar aldosteronproduktionen vid den slutliga syntesen med hjälp av nivån av aldosteron och MR. Detta steg förfinar ytterligare produktionen av aldosteron för att se till att den är lämplig för den miljö som organismen för närvarande befinner sig i. Naturligtvis ger det också ytterligare en punkt i dessa volymhomeostatiska mekanismer där dysfunktion kan leda till kardiovaskulär dysfunktion och sjukdom. Två rapporter är potentiellt relevanta för dessa möjligheter. I motsats till de aktuella studierna i normala ZG-celler där RU 486 inte hade någon effekt på aldosteronutsöndringen, under två förändrade förhållanden, primära aldosterontumörceller (Burton et al. 2011) och Zucker-obesitas hypertensiva råttor (Clapham & Turner 1997), undertryckte RU 486 plasmanivåerna av aldosteron men inte plasmanivåerna av kortikosteron. I likhet med denna studie ändrade RU 486 inte aldosteronnivåerna hos kontrollråttorna (Clapham & Turner 1997). Av intresse är att MR-antagonister i tumörcellerna inte hade någon effekt på aldosteronproduktionen. Aktivering av MR utfördes inte. Eftersom liknande nivåer av aldosteron och kortisol hittades i cellpreparaten fanns det cellblandning eller en förändrad celltyp (Burton et al. 2011). Slutligen kan resultaten av denna studie vara tillämpliga på regleringen av steroider utanför binjuren med deras troliga fysiologiska och kliniska relevans.
Hur modifierar förändringar i MR-aktivitet aldosteronutsöndringen? Ökningen av kortikosteronutsöndringen med ett samtidigt undertryckande av aldosteronproduktionen tyder på att den sena vägen för aldosteronbiosyntesen är den plats där regleringen sker. Det sista steget i aldosteronsyntesen är beroende av aktiviteten hos CYP11B2 (aldosteronsyntas) (Mornet et al. 1989). Den minskade omvandlingen av kortikosteron till aldosteron beror sannolikt på minskad aktivitet av CYP11B2 och inte på en förändring av CYP11B2-uttrycket på grund av den korta (1 timme) varaktigheten av våra experiment. Vårt fynd av minskade CYP11B2-proteinnivåer under HS-förhållanden och den föreslagna mekanismen för modifiering av CYP11B2-aktiviteten genom MR förklarar sannolikt dämpningen av den reglerande återkopplingsslingan vid en kost med hög salthalt.
Lågt natriumintag är en välkänd stimulator av aldosteronutsöndring (Marusic & Mulrow 1967, Aguilera & Catt 1979), och våra resultat är i linje med dessa rapporter. Vi observerade en förhöjning av kortikosteron i serum vid saltrik kost. I överensstämmelse med en ökning av serumkortikosteron uppvisade isolerade ZF/ZR-celler från råttor på en högsaltsdiet högre basal kortikosteronutsöndring. Mekanismerna genom vilka natrium i kosten påverkar kortikosteronutsöndringen har inte undersökts även om tidigare studier har visat att binjurarna hos natriumfattiga råttor har minskad utsöndring av kortikosteron (Eisenstein & Strack 1961). Kortikosteron kan produceras av både ZF/ZR och ZG, även om merparten av det cirkulerande kortikosteronet kommer från ZF/ZR på grund av deras betydligt större massa. Eftersom den basala kortikosteronfrisättningen från ZG-cellerna inte påverkades av förändringar i natriumintaget via kosten, drog vi emellertid slutsatsen att ZF/ZR-cellerna bidrog till ökningen av serumkortikosteron vid högt natriumintag.
Existensen av en intra-adrenal återkopplingsslinga som utövas av glukokortikoider och GR för att reglera glukokortikoidproduktionen har länge föreslagits av flera in vivo- (Peron et al. 1960, Hill & Singer 1968) och in vitro-studier (Morrow et al. 1967, Carsia & Malamed 1983). Dessa studier rapporterar kontrasterande resultat när det gäller huruvida glukokortikoider hämmar eller stimulerar glukokortikoidproduktionen. Regleringens riktning tycks bero på den experimentella modell som används och behandlingens längd. I den här studien ger vi bevis för en negativ reglerande återkoppling på kortikosteronutsöndringen som överensstämmer med Carsia & Malameds (1983) resultat, även om andra forskare har rapporterat motsatta resultat (Darbeida & Durand 1987, Li et al. 2011, Asser et al. 2014). Trots den stora mängden arbete är mekanismerna genom vilka glukokortikoider reglerar steroidogenesen inte väl förstådda. Våra resultat som visar en markant minskning av kortikosteronutsöndringen endast i ACTH-stimulerade ZF/ZR-celler vid DEX-behandling är i enlighet med Latner och medarbetare (Latner et al. 1977), som tyder på att glukokortikoider minskar bindningen av ACTH till sin receptor. Dessutom påverkade glukokortikoidantagonisten RU 486 inte den basala kortikosteronutsöndringen men stimulerade kortikosteronproduktionen av ACTH. Dessa uppgifter pekar på möjligheten att GR-aktivitet modifierar ZF/ZR-cellernas känslighet för ACTH. Andra arbeten med längre inkubationstider tyder på att glukokortikoider hämmar proteinsyntesen och reglerar transkriptionen på flera målgener i binjurebarken (Morrow et al. 1967, Asser et al. 2014). Även om denna förklaring verkar osannolik i vår studie på grund av våra experimentens längd kan vi inte utesluta möjligheten att genomiska effekter kan ha bidragit till våra observationer.
En överraskande upptäckt i vår studie var att ZF/ZR i motsats till ZG inte uppvisar receptorspecificitet. Aktivering av GR eller MR kan undertrycka kortikosteronproduktionen i ZF/ZR. MR-aktivering har rapporterats modulera glukokortikoidproduktionen, men denna effekt påvisas endast i hjärnan. Administrering av fludrokortison hos människor visade sig hämma kortisolkoncentrationerna genom nedreglering av hypotalamus-hypofysaxeln (HPA) (Otte et al. 2003, Buckley et al. 2007, Lembke et al. 2013). MR:s tydliga inflytande i glukokortikoid HPA-återkopplingskontrollen påvisades ytterligare när canrenonsyra visade sig ha en motsatt effekt på kortisol- och ACTH-sekretionen (Arvat et al. 2001, Wellhoener et al. 2004). Våra resultat tyder på att förutom att MR-aktiviteten centralt reglerar glukokortikoidproduktionen kan den också reglera den lokalt i binjuren, även om regleringen uppenbarligen beror på nivån av saltintag. På båda dieterna som svar på ACTH hämmar MR-aktivering kortikosteronproduktionen, men av oklara skäl tycks den på den saltfattiga dieten öka kortikosteronnivåerna. Med tanke på att blodflödet i binjuren in vivo går från ZG till ZF/ZR skulle aldosteron kunna ha en parakrin effekt på glukokortikoidproduktionen med intressanta fysiologiska och patofysiologiska implikationer.
En begränsning i studien var att kontaminering mellan zonerna glomerulosa och fasciculata potentiellt skulle kunna dölja förändringar som svar på olika stimuli. Vi anser att detta är osannolikt baserat på avsaknaden av CYP11B2 i ZF/ZR och mikroskopiska data, där ZF/ZR- och ZG-cellerna har tydligt olika egenskaper, visade liten eller ingen kontaminering i de två cellpreparaten. En andra begränsning är att den aktuella studien inte kan bedöma den relativa betydelsen av dessa parakrina jämfört med de klassiska endokrina effekterna som kontrollerar binjurebarkssteroidogenesen. En tredje begränsning är att vi inte vet om kortisol eller kortikosteron genom att interagera med MR kan ha samma effekt som aldosteron. Som tidigare nämnts skulle det dock, med tanke på blodflödets riktning från glomerulosa- till fasciculata-zonerna, om det inträffade inte vara en lokal, parakrin effekt. För det fjärde kan vi inte utesluta möjligheten av korsreaktivitet mellan MR-agonisten och MR-antagonisten med GR. Även om fludrokortison är känt för att utöva en viss glukokortikoid aktivitet är dess affinitet för MR 15 gånger högre än för GR (Agarwal et al. 1977). Det har inte funnits några rapporter som vi känner till om interaktionen mellan canrenonsyra och GR i någon dos. För det femte, när vi inte har sett någon effekt av en manipulation på den basala steroidproduktionen kan vi inte med säkerhet dra slutsatsen att det inte finns någon effekt, eftersom en lika trolig tolkning skulle vara att våra testsystem inte är tillräckligt känsliga för att uppfatta små effekter. Slutligen är extrapolering av dessa studier på råttor till människor osäker.
Slutsatsen är att utöver de klassiska, långa återkopplingsslingorna som reglerar binjurebarksteroidproduktionen stöder den aktuella studien hypotesen att det finns negativa ultrakorta regleringsslingor som förmedlas specifikt av MR på aldosteronutsöndringen och GR på kortikosteronproduktionen i isolerade ZG- respektive ZF/ZR-celler. Vi rapporterar här det oväntade resultatet att MR-aktivering också negativt reglerar glukokortikoidsekretionen i ZF/ZR-celler. Hur dessa korta återkopplingsslingor interagerar med deras långa återkopplingsslingor är osäkert. Dessa fynd väcker dock spännande frågor om den fysiologiska regleringen och den potentiella patofysiologiska dysregleringen av produktionen av dessa steroider.