Kanalens slussar fungerar tack vare gravitationsflödet av vatten från sjöarna Gatún, Alajuela och Miraflores, som matas av Chagres och andra floder. Själva slussarna är av enhetlig längd, bredd och djup och byggdes i par för att möjliggöra samtidig passage av fartyg i båda riktningarna. Varje slussport har två blad, 65 fot (20 meter) breda och 6,5 fot (2 meter) tjocka, som sitter på gångjärn. Portarna är mellan 14 och 25 meter höga och rör sig med hjälp av elmotorer som är infällda i slussväggarna. De styrs från ett kontrolltorn som är placerat på väggen som skiljer varje sluss par från varandra och från vilket man också styr översvämningen eller tömningen av slusskamrarna. Slusskamrarna är 300 meter långa, 33 meter breda och 12 meter djupa.

På grund av de ursprungliga slussmekanismernas ömtåliga natur tillåts endast små båtar att passera genom slussarna utan assistans. Större farkoster leds av elektriska bogseringslokomotiv som går på kugghjulsspår på slussväggarna och som tjänar till att hålla fartygen centrerade i slussen. Innan man kan gå in i en sluss måste man passera en fenderkedja som är spänd mellan väggarna i infarten. Om allt går som det ska släpps kedjan ner i sitt spår i botten av kanalen. Om fartyget av någon anledning rör sig för snabbt för att vara säkert kommer kedjan att förbli utsträckt och fartyget kommer att köra mot den. Kedjan, som drivs av ett hydrauliskt maskineri i väggarna, kommer då att sakta lossna genom automatisk utlösning tills fartyget har stannat. Om fartyget skulle komma bort från det bogserande lokomotivet och, genom att bryta igenom kedjan, ramma den första grinden, kommer en andra grind 15 meter bort att skydda slussen och stoppa vidare framfart.

De tredje slussarna i projektet Third Set of Locks, som påbörjades 2007, har inspirerats av Berendrecht-slussen i Antwerpen, Belgien, och vattenbesparande bassänger som används i kanaler i Tyskland. Cirka 190 000 ton stål, mestadels från Mexiko, förankras i kraftigt armerad betong för att bygga slusskamrarna på Atlant- och Stillahavssidan, och de nya slussportarna är upp till 10 meter breda, 30 meter höga och 58 meter långa. De nya kamrarna och bassängerna, som kommer att kontrollera det vatten som strömmar från Gatún-sjön, har utformats för att minimera turbulensen i vattenflödet och störningarna för de fartyg som passerar. Bassängerna färdigställdes i juni 2016 och omfattar 158 ventiler som består av 20 000 ton konstruktionsmaterial. Tjänstemännen säger att dessa vattenbesparande bassänger är de största i världen och underlättar en 60-procentig återanvändning av vatten. Medan de befintliga slussarna använder 52 miljoner gallon (197 miljoner liter) vid varje användning, använder de nya slussarna 48 miljoner gallon (182 miljoner liter).