Den följande detaljerade förklaringen av serologiska tester för celiaki har skrivits av Tom Ryan, Technical Service Specialist, INOVA Diagnostics, Inc.

Det har på senare tid diskuterats en hel del om serologiska tester för celiaki, särskilt när det gäller testning av tTG (tissue transglutaminase). Jag ska försöka besvara några av de många frågor som har dykt upp på denna lista om alla tester. För det första, och detta gäller alla blodtester, måste man för närvarande äta en glutenhaltig kost för att testerna ska vara korrekta. Antikroppar produceras av immunsystemet som svar på ämnen som kroppen uppfattar som hotfulla. Det immunsvar som din kropp producerar är dess svar på att den utsätts för gluten i kosten och dess efterföljande effekt på tarmslemhinnan. Om det inte finns något gluten i kosten finns det ingen reaktion som vi kan mäta. En kort förändring av kosten kommer inte att ha någon märkbar effekt. Om du har varit glutenfri i en vecka eller så kommer det inte att göra någon större skillnad. Reaktionen kan vara marginellt mindre, men skillnaden är obetydlig eftersom kroppen inte har haft tid att reagera på förändringen. Omvänt, om du har varit glutenfri under en längre tid och bestämmer dig för att testa dig, är en kort utmaning på ett par veckor inte tillräcklig för att framkalla en reaktion och få ett korrekt test.

Det är flera steg som sker för att generera ett immunsvar och det tar tid både för den positiva reaktionen när gluten finns och för att rensa antikropparna när gluten elimineras. Det har diskuterats mycket om hur mycket och hur lång en utmaning ska vara och det finns ingen konsensus. Prata med din läkare. Min personliga känsla är att minimum är 2 brödskivor per dag i 6 veckor för att få ett korrekt test, men jag skulle inte försöka att ifrågasätta läkaren. Det finns i princip fyra tester som kan utföras för att hjälpa till att diagnostisera celiaki. Lägg märke till att jag säger att de hjälper till att diagnostisera celiaki. Immunologi är ganska exakt men det är långt ifrån en exakt vetenskap. Alla laboratorietester, oavsett typ eller källa, presenteras som hjälpmedel för diagnosen. De bör inte användas ensamma som grund för diagnosen utan är snarare avsedda att beaktas i samband med den fysiska undersökningen av patienten samt de rapporterade symtomen etc. av en utbildad läkare. Det har rått en hel del förvirring om vad testerna är och jag hoppas att jag kan lindra några av missförstånden. Det finns många termer som vi hör. tTG, IgA, IgG, ELISA osv. Vad är alla dessa? En del som bidragit till listan hänvisar till IgA- eller IgG-testet eller till ELISA-testet. Dessa beteckningar är ofullständiga för våra syften och kan hänvisa till ett antal olika tester.

Vi har alla, i våra kroppar, en familj av närbesläktade men inte identiska proteiner som kan fungera som antikroppar. Dessa benämns gemensamt som immunoglobuliner. Fem huvudtyper av immunglobuliner finns normalt hos vuxna människor. De är IgG, IgA, IgM, IgE och IgD. Var och en av dessa är ett kortfattat sätt att skriva immunoglobulin gamma G (eller A eller M osv.) och de har alla olika funktioner i våra system. IgG är det viktigaste immunglobulinet i mänskligt serum. Det är viktigt för att skapa immunitet hos ett foster under utveckling eftersom det passerar över placentabarriären. IgA är det viktigaste immunglobulinet i sekret från luftvägs- och tarmslemhinnor. IgE är ett gammaglobulin som produceras av celler som kantar tarm- och luftvägarna. Det producerar de antikroppar som förknippas med de flesta överkänslighetsreaktioner (allergiska reaktioner). Det är förknippat med astma, hösnuva osv. IgM är ett globulin som bildas i nästan alla immunsvar i den tidiga delen av reaktionen. IgD är ett sällsynt protein som finns i en liten mängd i normala serum. Dessa beteckningar hänvisar till den typ av protein som bär på antikroppen i fråga. Både IgG- och IgA-subtyper av anti-gliadinantikroppar produceras, varför vi hänvisar till dem som IgG-gliadin eller IgA-gliadin. Tillsammans är de anti-gliadin-antikroppar.

Anti-gliadin-antikroppar:

Både IgA- och IgG-anti-gliadin-antikroppar (AGA) påvisas i serum från patienter med glutenkänslig enteropati (celiaki). IgG-anti-gliadin-antikroppar är mer känsliga men mindre specifika markörer för sjukdom jämfört med IgA-klassantikroppar. IgA-anti-gliadinantikroppar är mindre känsliga men mer specifika. I kliniska prövningar har IgA-antikropparna en specificitet på 97 % men känsligheten är endast 71 %. Det innebär att om en patient är IgA-positiv är sannolikheten att han eller hon har celiaki 97 %. Omvänt, om patienten är IgA-negativ är sannolikheten för att patienten verkligen är negativ för celiaki endast 71 %. Därför är ett positivt resultat en stark indikation på att patienten har sjukdomen, men ett negativt resultat betyder inte nödvändigtvis att patienten inte har sjukdomen. Falskt positiva resultat är ganska ovanligt, men falskt negativa resultat kan förekomma. Å andra sidan är IgG-anti-gliadin-antikroppar specifika till 91 % och har en känslighet på 87 %. Detta innebär att de lättare visar positiva resultat, men det finns inte ett lika starkt samband med celiaki. Det är mindre specifikt. Patienter med andra sjukdomar men som inte drabbats av celiaki kommer ibland att visa positiva resultat. IgG anti-gliadin-antikroppar kan påvisas hos cirka 21 % av patienter med andra gastrointestinala sjukdomar. Detta test kan ge falskt positiva resultat men är mindre sannolikt att ge falskt negativa resultat.

Ett känsligt testprotokoll innefattar testning av både IgA- och IgG-anti-gliadinantikroppar eftersom en betydande del av celiakipatienterna (ca 2-5 %) har IgA-brist. Detta kombinerade test för IgA- och IgG-anti-gliadinantikroppar har en total känslighet på 95 % och en specificitet på 90 %. Den typ av test som används för att påvisa anti-gliadinantikroppar kallas ELISA. Detta är en akronym och står för Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay. ELISA är inte ett test i sig självt. Det är en testmetod och det är ett relativt enkelt test att utföra. Det innebär att man lägger en uppmätt mängd utspätt patientserum i brunnarna på en särskilt konstruerad och förberedd platta och inkuberar det under en viss tid med olika kemikalier. Slutresultatet är en färgförändring, vars intensitet är beroende av koncentrationen av anti-gliadinantikroppar (eller annat protein som ska mätas) i patientserumet. Denna färgade lösnings förmåga att absorbera ljus vid en viss våglängd kan mätas på ett laboratorieinstrument och matematiskt jämföras med lösningar som innehåller en känd mängd anti-gliadinantikroppar för att få fram ett tal för mängden närvarande antikroppar. Provet kan sedan klassificeras som negativt (0-20 enheter), svagt positivt (21-30 enheter) eller måttligt till starkt positivt om det är större än 30 enheter. Syftet med att testa anti-gliadin-antikroppar är, förutom att diagnostisera glutenkänslig enteropati, att övervaka att en glutenfri diet följs. IgA-gliadinantikroppar ökar snabbt som svar på gluten i kosten och minskar snabbt när gluten saknas i kosten. IgA-anti-gliadin-antikropparna kan försvinna helt inom 2-6 månader på en glutenfri diet, så de är användbara som dietkontroll. IgG-anti-gliadinantikroppar behöver däremot lång tid, ibland mer än ett år, för att bli negativa. Det omvända gäller också. Det vill säga, en patient med celiaki som har gått på en glutenfri diet och som är negativ för IgA-anti-gliadin-antikroppar kommer att visa en snabb ökning av antikroppsproduktionen när han eller hon utmanas av gluten i kosten. Ungefär 90 % av de patienter som utmanas kommer att ge ett positivt IgA-anti-gliadin-resultat inom 14-35 dagar efter utmaningen. IgG-antikropparna är något långsammare.

Endomysiella antikroppar:

IgA-klassens anti-endomysiella antikroppar (AEA) är mycket specifika och förekommer endast vid celiaki och DH. Dessa antikroppar finns hos cirka 80 % av patienterna med DH och hos i princip 100 % av patienterna med aktiv celiaki. IgA endomysiella antikroppar är mer känsliga och specifika än gliadinantikroppar för diagnos av celiaki. Antikroppstitrar (utspädningar) har visat sig vara parallella med morfologiska förändringar i jejunum och kan också användas för att återspegla följsamheten till glutenfri kost. Titrarna minskar eller blir negativa hos patienter som följer glutenfri kost och återkommer vid glutenutmaning.

Testet för anti-endomysiella antikroppar är mer subjektivt och mer komplicerat för laboratoriet att utföra än anti-gliadinanalyserna. Det innebär att man seriellt späder ut en del av patientens serum, dvs. späder ut det med ½, sedan ¼, 1/8, 1/16 osv. och lägger dessa utspädningar på ett glasobjektsglas med någon form av vävnad fastsatt på det. Man behandlar sedan objektglaset med olika lösningar och undersöker det i ett fluorescerande mikroskop för att avgöra om något av serumet binder till något av proteinerna i vävnaden. Om så är fallet bekräftas det att patienten har antikroppar mot det aktuella proteinet. Denna testmetod kallas IFA eller ibland IIFA. Det står för Indirect Immuno-Fluorescent Assay. Valet av vilket vävnadsglas som ska användas bestäms av vilket specifikt protein, och därmed vilken antikropp, man specifikt letar efter. Endomysiella antikroppar reagerar med endomysium, som är ett hölje av retikulära fibriller som omger varje muskelfiber. För att påvisa endomysiella antikroppar bör man därför använda ett vävnadssubstrat som innehåller mycket muskelvävnad. Det substrat som oftast används för denna analys är distala sektioner av matstrupen. Dessa skärs i mycket tunna skivor och fästs på objektglaset. De innehåller muskelfibrer och inte mycket annat, så det finns mycket endomysium tillgängligt för att reagera med de anti-endomysiella antikropparna.

Avläsning av detta test innebär att man tittar på de reagerade objektglasen med ett fluorescerande mikroskop för att göra bestämningen. Detta kräver ett mycket skickligt och tränat öga och är av nödvändighet något subjektivt. Man letar efter en grön fluorescens i endomysium som täcker muskelfibrerna. Testet rapporteras som den titer eller slutspädning i vilken fluorescensen fortfarande tydligt kan ses. Som ni kan föreställa er är detta mycket subjektivt. Det finns inga standardiserade värden och det är upp till den enskilda teknikerns bedömning vad slutpunktstitern är. Nyligen (1998) identifierades det endomysiella antigen som antiendomysiella antikroppar riktar sig mot som det tvärbindande enzymet som kallas vävnadstransglutaminas (tTG). Detta har gjort det möjligt att framställa en antigenspecifik ELISA-test som innehåller tTG som ett tillförlitligt och objektivt alternativ till de traditionella och subjektiva immunofluorescensbaserade testerna. I kliniska prövningar har korrelationen med den endomysiella IFA-analysen visat sig vara nära 100 %. Detta är ett test som har tagits emot mycket väl i yrkesvärlden. Det är ett ELISA-test, liksom testet för anti-gliadinantikroppar, och kan därför inte tolkas som IFA-testet. Det är den största fördelen med detta nya test! Med detta eller andra ELISA-test mäts svaret på ett instrument som beräknar hur mycket ljus av en viss våglängd som absorberas av lösningen och skriver ut ett numeriskt resultat. Det finns ingen risk för att mänskliga fel kan förvränga resultaten eftersom det inte finns någon bedömning att göra. ELISA-plattan, oavsett vad man testar för, bearbetas med minst tre kontrollsera (ibland så många som åtta) utöver det okända prov som testas. Det finns ett negativt serum och minst två positiva serum som innehåller olika nivåer av den antikropp som testas. Det finns särskilda krav på absorptionsnivåerna hos dessa tre kontroller. Det vill säga, var och en av dem har ett lägsta eller högsta (eller båda) antal som måste ses av instrumentet för att det ska vara ett giltigt test. Om det finns någon avvikelse från dessa förväntade tal är det en indikation på att något gick fel och testresultaten kasseras och testet upprepas. Det finns därför inget sätt för teknikern att rapportera felaktiga resultat (förutsatt att han eller hon har spätt provet på rätt sätt). Antingen var testet giltigt, och du kan lita på resultatets noggrannhet, eller så är testet ogiltigt, och hela resultatet kan kasseras. Om något fel begicks under bearbetningen av ELISA-plattan skulle det resultera i att kontrollsera-numren ligger utanför intervallet och hela testresultatet skulle kastas.

Sammanfattningsvis mäter tTG-ELISA samma sak som den endomysiella IFA-analysen mäter, men med en metod som är mer känslig och specifik och som inte är föremål för tolkningar. IgA-klass Reticulin-antikroppar finns endast vid celiaki och dermatitis herpetiformis. Dessa antikroppar finns hos cirka 60 % av celiakipatienterna och 25 % av DH-patienterna. Detta test håller på att avvecklas på grund av den begränsade användbarheten och tillgången till bättre tester. Det är en IFA som utförs på ett vävnadssubstrat med alla de problem som följer med det. Utvecklingen av alla dessa serumanalyser har förenklat diagnosen av celiaki enormt och förbättrat noggrannheten. De ursprungliga kriterierna för diagnos enligt European Society for Pediatric Gastroenterology and Nutrition, (ESPGAN), innebar ett års mödosamma studier med:

• En första positiv tarmbiopsi;
• 6 månader med glutenfri kost;
• En andra negativ tarmbiopsi;
• En glutenutmaning i 6 månader och;
• En tredje positiv tarmbiopsi. Enligt de reviderade ESPGAN-kriterierna krävs positiva resultat i två av de serologiska testerna som bekräftas av en enda positiv biopsi. I praktiken använder många gastroenterologer serologierna tillsammans med en kontrollerad diet och den kliniska presentationen för att bilda en grund för diagnos utan behov av det invasiva ingreppet.

På uppdrag av Celiac Disease Foundation och andra anordnades tidigare i år ett professionellt symposium och en workshop i Marina Del Rey, Kalifornien, med deltagare från såväl Europa som USA, för att fastställa standarder för rapportering av testresultat. Detta bör förbättra testning och diagnostik ytterligare. Efter konferensen bildades en standardiseringskommitté för celiaki för att utreda och ge rekommendationer om en standardiserad metod för att rapportera resultat.