Abstract
Vi undersökte effekterna av vanadiumsulfatbehandling (VOSO4) med 5 och 10 mg/kg i 30 dagar på endokrina bukspottkörtelns aktivitet och histologi hos icke-diabetiska och STZ-inducerade diabetiska råttor. I den diabetiska gruppen ökade blodglukosnivåerna signifikant medan insulineminivån minskade markant. I slutet av behandlingen normaliserade VOSO4 i en dos av 10 mg/Kg blodglukosnivån i den diabetiska gruppen, återställde insulinemi och förbättrade signifikant insulinkänsligheten. VOSO4 ökade också på ett dosberoende sätt antalet insulinimmunopositiva betaceller i bukspottkörtelns öar hos icke-diabetiska råttor. I den STZ-diabetiska gruppen korrigerades dessutom minskningen av antalet insulinimmunopositiva betaceller för att nå kontrollnivån främst med den högre dosen vanadin. Därför normaliserade VOSO4-behandling plasmaglukos- och insulinnivåerna och förbättrade insulinkänsligheten vid STZ-experimentell diabetes och inducerade betacellernas proliferation och/eller regeneration hos normala eller diabetiska råttor.
1. Introduktion
Vanadium är en övergångsmetall. Det uppskattas att mer än 60 tusen ton av detta grundämne släpps ut i atmosfären varje år som ett resultat av mänsklig verksamhet främst från förbränning av fossila bränslen .
När vanadiumföreningar kommer in i cirkulationssystemet via mag- och tarmkanalen eller andningsvägarna transporteras de av transferrin eller, mer sällan, av albumin eller lågmolekylära komponenter i plasma, t.ex. citrater och, i mindre utsträckning, laktater eller fosfater . Många studier har utförts på oorganiska och organiska vanadinderivat i djurmodeller med inducerad diabetes, där de studerade föreningarna visade sig påverka glukos-, kolesterol- och triglyceridnivåerna utan några betydande skadliga bieffekter vid långvarig administrering . Många experiment utfördes också på diabetespatienter och bekräftade den terapeutiska effekten av vanadiumföreningar på blodglukosnivåerna med små toxiska effekter .
Vanadium (inklusive vanadyl och vanadat) har visat sig sänka blodglukosnivån genom att stimulera glykogenes, glukosupptag och metabolism och genom att hämma glukosbildningen via hepatisk glukoneogenes och glykogenolys . Man har funnit att vanadin och vanadinföreningar uppvisar en insulinliknande aktivitet genom att imitera insulinets verkan via insulinreceptortyrosinkinasaktivering och kinasfosforyleringskaskadvägar . Därför har vanadylsulfat föreslagits som ett terapeutiskt medel för behandling av typ 1-diabetes . Streptozotocinbehandling (STZ) förstör de insulinproducerande betacellerna i bukspottkörteln och STZ-inducerade diabetiska råttor betraktas som en modell för typ 1-diabetes mellitus . Även om vanadinföreningar har visat sig ha antidiabetiska egenskaper i STZ-inducerad diabetesmodell, är mekanismen för deras verkan fortfarande under utredning. Syftet med denna studie var att undersöka svaren på 30 dagars behandling med vanadinsulfat hos icke-diabetiska och STZ-inducerade diabetiska råttor.
2. Material och metoder
2.1. Förberedelse av diabetiska råttor
Djuren gjordes diabetiska genom en intraperitoneal injektion (ip) av STZ i en engångsdos på 65 mg/Kg i 0,01 M citratbuffert (pH 4,5). Denna ip-metod valdes baserat på nyligen publicerade rapporter som visade en uttalad glukoshöjande effekt hos STZ-diabetiska råttor .
2.2. Djur och behandling
Manliga Wistar-råttor, 5-6 veckor gamla (vikt 175-200 g), köptes från Pasteurinstitutet i Tunisien och användes i enlighet med den lokala etiska kommittén vid universitetet i Tunis för användning och vård av djur i enlighet med NIH:s rekommendationer. De fick mat (standardpelletsdiet-Badr Utique-TN) och vatten ad libitum och hölls fem stycken per bur i samlad temperatur (22 °C) med 12 timmars ljus- och mörkercykel. Råttorna delades in i sex grupper.
Grupp 1 var icke-diabetiska kontrolldjur (ND-kontroll) och fick dagligen en intraperitoneal injektion (ip) av NaCl 9. Grupperna 2 och 3 var ND och fick dagligen en dos av antingen 5 eller 10 mg VOSO4/Kg respektive (ND + 5 mg/Kg och ND + 10 mg/Kg) i 30 dagar. Grupp 4 var en diabeteskontroll (D-kontroll) som injicerades med en engångsdos på 65 mg/Kg STZ. Grupperna 5 och 6 bestod av STZ-diabetiska djur som behandlades med antingen 5 eller 10 mg/Kg VOSO4 under 30 dagar (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). STZ-grupperna behandlades med VOSO4 efter 48 timmars STZ-inducerad diabetes.
2.3. Biokemiska analyser
Alla djur fastade 12 timmar innan glykemin bestämdes med en glukometer (ACCU-CHEK-Active Roche). Insulinkänsligheten mättes efter ip-injektion av 1 U/Kg insulin och blodglukosnivåerna bestämdes med 30 minuters mellanrum under 2 timmar som procent av hormonnivån vid .
Djuren offrades efter 24 timmar efter den sista behandlingen och blodet samlades upp och serumet bearbetades för uppskattning av insulin som bestämdes med Elisa-kit (distribuerat av BioVendor).
2.4. Immunohistokemisk utvärdering
Immunohistokemisk färgning av insulin utfördes för att karaktärisera betacellernas integritet i Langerhansöarna. För detta valdes vävnadssektioner som visade den maximala större ytan av Langerhansöarna ut för jämförelser mellan grupperna. Sektionerna avparaffinerades först, hydrerades genom en avtagande gradvis etanolserie, sänktes i tampongcitrat (pH 6) i 40 minuter och inkuberades sedan med en polyklonal antikropp mot insulin från marsvin utspädd i 50 mM Tris-HCl, pH 7,6 (DAKO). Efter tvättning inkuberades sektionerna med fosfataskonjugerad anti-Guinea Pig-antikropp och avslöjningsförfarandet assisterades av TechMate 500-maskinen. Slutligen färgades sektionerna med hematoxylin/eosin.
Tio bukspottkörtelns öar per råtta undersöktes i mikroskop och antalet insulinpositiva och insulinnegativa celler räknades genom att deras kärnor numrerades. Data uttrycks som procent av insulinimmunopositiva celler/totalt antal celler i varje ö.
2.5. Statistisk analys
Signifikansen av skillnaden mellan olika grupper utvärderades genom envägsanalys av varians (ANOVA) följt av Tukeys multipeljämförelsetest, och värdet betraktades som signifikant på nivån.
3. Resultat
Effekten av VOSO4-behandling på blodglukosnivåerna hos icke-diabetiska (ND) och diabetiska (D) råttor visas i figur 1. Det fanns inga signifikanta förändringar i blodglukosnivåerna i kontrollgruppen ND under behandlingen (figur 1 a)). Behandling av ND-råttor med VOSO4 på 5 eller 10 mg/Kg ändrade inte blodglukosnivåerna nämnvärt under de första 10 dagarna. Blodglukosnivån minskade dock signifikant i slutet av behandlingen med dosen 5 mg/Kg och minskade signifikant från 15 till 30 dagar med dosen 10 mg/Kg jämfört med kontroll-ND-gruppen. Vid dag 30 var glykemisänkningen cirka 8 respektive 15 % för doserna 5 och 10 mg/Kg jämfört med kontrollgruppen. Som misstänkt observerades en anmärkningsvärd ökning av blodglukosnivån hos de STZ-behandlade kontrollråttorna jämfört med de obehandlade djuren ( mot mg/dL) vilket indikerar en diabetesinstallation som bibehölls under hela försöket. Behandling av den diabetiska gruppen (D) med 5 mg/Kg VOSO4 minskade signifikant blodglukosnivån från dag 10 medan en dos på 10 mg/Kg minskade blodglukosnivån signifikant och gradvis från dag 5 för att nå normal nivå på dag 30. De noterade värdena för glykemi vid 30 dagar var och mot mg/dl, respektive i grupperna D + 5, D + 10 och kontroll D (figur 1(b)).
Tabell 1 visade insulinnivåerna i ND- och D-grupperna utan och efter VOSO4-behandling. De ND-råttor som behandlades med 5 mg/Kg VOSO4 uppvisade inga signifikanta förändringar i insulinnivån, men en markant ökning erhölls med 10 mg/Kg jämfört med kontroll-ND-gruppen ( mot µg/L). I kontroll D-gruppen minskade dessutom insulineminemin djupt i jämförelse med kontroll ND-djuren ( jämfört med µg/L). Administrering av VOSO4 i D-grupper ökade markant insulinemin på ett dosberoende sätt. Faktum är att insulinnivåerna ökade hos diabetiska råttor från till och µg/L med respektive 5 mg och 10 mg/Kg doser.
Insulinkänslighetsförändringar efter ip-injektion av insulin (1 U/Kg) hos normala och diabetiskt behandlade djur visas i figur 2. Hos ND-råttor förändrade behandling med 10 eller 5 mg VOSO4 inte glykemiprofilen som svar på insulinadministration (figur 2 a)). I dessa grupper observerades den maximala hypoglykemiska effekten av insulin efter 60 respektive 90 minuter och var ungefär lika stor som det ursprungliga glykemivärdet. Diabetiska djur som behandlades med den låga dosen av VOSO4 uppvisade en liknande glykemiprofil som kontrollgruppen D med en maximal minskning efter 60 minuter, medan de som behandlades med den höga dosen uppvisade en signifikant () och snabb maximal minskning av glykemin efter 30 minuter efter insulininjektion (figur 2 b)).
I behandlingsgrupperna med VOSO4 observerades att bukspottkörtelns öar var större än i deras respektive kontrollgrupper ND och D (figurerna 3 och 4). Statistiska analyser visade att VOSO4-behandlingar inducerade en markant ökning av antalet insulinimmunopositiva celler med cirka 20 % i ND + 5 och 27 % i ND + 10 mg/Kg-grupperna (figur 5). VOSO4-behandling ökade signifikant antalet insulinimmunopositiva celler i STZ-diabetesgrupperna på ett dosberoende sätt med 12 respektive 23 % med 5 och 10 mg/Kg doser (figur 5). En jämförelse mellan STZ-diabetikerbehandlade grupper och ND-kontrollråttor visade inga signifikanta skillnader.
(a)
(b)
(c)
(a)
(b)
(c)
Immunohistokemisk färgning av insulin i Langerhanska öarnas betaceller i bukspottkörteln från STZ-diabetiska råttor. Observera att det finns fler immunopositiva insulinceller i behandlade STZ-diabetiska råttor än i obehandlade STZ-diabetiska råttor. Kontroll D (a), D behandlad med 5 mg/Kg VOSO4 (b) och D behandlad med 10 mg/Kg VOSO4 (c). Tio öar per råtta analyserades. Skala:
Effekt av vanadylsulfat på antalet betaceller i %. Värden representerar medelvärde ± SD. ; jämfört med ND-kontroll. ; jämfört med D-kontroll. jämfört med D + 5 mg/Kg. 10 öar per råtta analyserades.
4. Diskussion
Vi studerade de antidiabetiska egenskaperna hos vanadin genom att utforska dess effekter på blodglukos- och insulinnivåer samt B-celler i den endokrina bukspottkörteln.
Med hjälp av STZ-inducerade diabetiska råttor visade vi att behandling med vanadylsulfat (VOSO4) vid 5 och 10 mg/Kg signifikant minskade de genomsnittliga blodglukosnivåerna vid 10:e respektive 5:e dagen i jämförelse med obehandlad kontrollgrupp. Vid dag 30 uppvisade diabetiska råttor som fått den högre dosen av föreningen liknande glykeminivåer som ND-kontrolldjur. Hos ND-råttor förändrade dock behandlingen med den lägre dosen av VOSO4 inte blodglukosnivån nämnvärt, medan den högre dosen gav upphov till en liten och gradvis minskning vid den 15:e behandlingsdagen och glykemin minskade med cirka 14 % vid den 30:e dagen. Våra resultat stämmer överens med tidigare data som visar att oral administrering av vanadiumföreningar i STZ-inducerade eller genetiskt nedärvda eller näringsdiabetiska djur signifikant förbättrade hyperglykemin . Hos människor rapporterade Soveid et al. säkerheten och effekten av oral behandling med vanadylsulfat under en 30-månadersperiod hos typ 1-diabetiker genom att minska insulinbehovet och blodglukosnivån.
Vår studie avslöjade också att den hypoglykemiska effekten av VOSO4 åtföljdes av en markant ökning av den basala insulineminivån i den diabetiska gruppen på ett dosberoende sätt. Med dosen 10 mg normaliserades insulinemienivån hos diabetiska råttor nästan. Faktum är att den minskning av blodglukosnivåerna som registrerades särskilt hos diabetiska råttor som exponerades för vanadiumföreningen kan vara relaterad till den samtidiga ökningen av plasmainsulinkoncentrationerna. Dessa resultat överensstämde med tidigare uppgifter om vanadinföreningars effektivitet när det gäller att förbättra det diabetiska tillståndet .
Fortfarande har vi undersökt effekten av vanadinadministrering på insulinkänsligheten hos diabetiska och icke-diabetiska råttor. I ND-grupperna visade vi en maximal hypoglykemisk effekt av insulin vid 60-90 minuter efter hormonintroduktion. I D-grupper ökade dock VOSO4-behandling med en dos på 10 mg insulinkänsligheten med en snabbare och mer uttalad minskning av blodglukos efter hormoninjektion, medan dosen 5 mg inte nämnvärt förändrade glykemisvaret hos D-råttor. Den förbättrade insulinkänsligheten inducerad av VOSO4 är i linje med många studier som indikerar att vanadin kan betraktas som en potent insulinmimetisk eller insulintrofisk i olika vävnader .
Det har visats att vanadinföreningar kännetecknas av flera verkningsvägar som resulterar i blodsockersänkning . Studier in vivo och in vitro rapporterade att vanadylsulfat ökade glukostransport och metabolism i skelettmuskler, lever och fettvävnad . Tack vare sin strukturella likhet med ortofosfatanjoner hämmar de organiska vanadiumderivaten proteinfosfotyrosinfosfatas . De hämmar också aktiviteten hos PTP-1B, ett enzym som ansvarar för defosforylering av insulinreceptorn, vilket orsakar insulinresistens . En annan mekanism för minskning av blodglukosnivåerna genom vanadinföreningar är aktivering av PKB/Akt-kinas som leder till ökat glukosupptag genom GLUT4-transportören . Aktiveringen av PKB/Akt stimulerar också fosforyleringen av GSK3, vilket leder till att glykogensyntesen stimuleras . Å andra sidan fann man att inhibering av C-jun N-terminalt kinas förbättrar insulinkänsligheten vid experimentell diabetes .
Vanadium ökar glukostransporten och oxidationen och insulinreceptortyrosinkinasaktiviteten och utövar insulinliknande effekter på glukos- och lipidmetabolismen genom insulinberoende eller insulinoberoende biokemiska vägar .
Det är välkänt att STZ-behandling förstör betacellerna i bukspottkörtelns öar, vilket leder till insulinberoende diabetes mellitus . I den aktuella studien visade vi därför en minskning av arean av bukspottkörtelns öar i samband med en markant minskning av antalet immunreaktiva betaceller för insulin i den diabetiska gruppen i jämförelse med icke-diabetiska kontrolldjur. I både ND- och D-grupperna ökade dock VOSO4-behandlingen storleken på bukspottkörtelöarna jämfört med respektive kontrollgrupp. Viktigast är att VOSO4-behandling av diabetiska råttor på ett dosberoende sätt ökade antalet insulinimmunopositiva betaceller jämfört med den diabetiska obehandlade gruppen, vilket tyder på att VOSO4 kan generera betaceller hos STZ-inducerade diabetiska råttor. Faktum är att antalet betaceller i öarna hos diabetiska VOSO4-behandlade råttor med 5 och 10 mg inte var signifikant annorlunda än i ND-gruppen. Detta stämmer överens med tidigare undersökningar om den pankreatiska insulinotropa egenskapen hos denna förening . Intressant nog ökade vanadinbehandlingen också avsevärt antalet betaceller i öarna hos icke-diabetiska råttor.
I en musmodell av pankreas med alloxanperfusion rapporterade Waguri et al. om processer för regenerering av betaceller från prekursorceller utanför öarna. I STZ-diabetiska råttor kan behandling med VOSO4 faktiskt stimulera betacellernas proliferation från intraislet endokrina celler och differentiering från extraislet prekursorceller.
Sammanfattningsvis visar den aktuella studien att vanadylsulfat skulle kunna vara användbart som ett potentiellt antidiabetiskt medel. Men eftersom de nuvarande bevisen fortfarande är begränsade och mestadels baserade på djurmodeller, och eftersom lite är känt om de terapeutiska formuleringarna och biverkningarna av vanadiumföreningar, behövs ytterligare undersökningar om deras långtidsanvändning som konventionell terapi för diabetespatienter.
Intressekonflikter
Författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter i samband med publiceringen av denna artikel.
Ansvar
Detta arbete stöddes av det tunisiska ministeriet för högre utbildning och vetenskaplig forskning.