Den protestantiske reformation var en religiøs bevægelse, der fandt sted i Vesteuropa i det 16. århundrede, og som resulterede i en splittelse i kristendommen mellem romersk-katolikker og protestanter. Denne bevægelse “skabte en splittelse mellem nord og syd i Europa, hvor de nordlige lande generelt blev protestantiske, mens de sydlige lande forblev katolske.”
Reformationen skabte to hovedgrene af protestantismen; den ene var de evangelisk-lutherske kirker, som fulgte Martin Luthers lære, og den anden var de reformerte kirker, som fulgte John Calvins og Huldrych Zwinglis idéer. Ud af disse grene voksede tre hovedsekter, den lutherske tradition samt den kontinentale reformerte og den anglikanske tradition, hvoraf de to sidstnævnte følger den reformerte (calvinistiske) tro. Lutheranere og reformerte kristne havde forskellige holdninger til religiøse billeder.
Martin Luther i Tyskland tillod og tilskyndede til at vise et begrænset udvalg af religiøse billeder i kirkerne, idet han så den evangelisk-lutherske kirke som en fortsættelse af den “gamle, apostolske kirke”. Brugen af billeder var et af de emner, hvor Luther gik stærkt imod den mere radikale Andreas Karlstadt. I nogle få år blev der i Tyskland fremstillet lutherske altertavler som den yngre Cranachs sidste nadver, især af Luthers ven Lucas Cranach, som erstatning for de katolske altertavler, der ofte indeholdt portrætter af ledende reformatorer som apostle eller andre hovedpersoner, men som bibeholdt den traditionelle fremstilling af Jesus. Som sådan blev “den lutherske gudstjeneste en kompleks rituel koreografi i et rigt udsmykket kirkerum”. Lutheranerne fortsatte brugen af krucifikset, da det understregede deres høje syn på korsets teologi. Der voksede historier op om “uforgængelige” billeder af Luther, som havde overlevet brande ved guddommelig indgriben. For lutheranerne fornyede reformationen således “det religiøse billede snarere end at fjerne det.”
På den anden side var der en bølge af ikonoklasme, eller ødelæggelse af religiøse billeder. Dette begyndte meget tidligt i reformationen, da studerende i Erfurt i december 1521 ødelagde et træalter i franciskanerklostret i december 1521. Senere viste den reformerte kristendom konsekvent fjendtlighed over for religiøse billeder, som afgudsdyrkelse, især skulpturer og store malerier. Bogillustrationer og tryksager var mere acceptable, fordi de var mindre og mere private. Reformerede ledere, især Huldrych Zwingli og John Calvin, fjernede aktivt billedkunst fra kirker under deres tilhængeres kontrol og betragtede det store flertal af religiøse billeder som afgudsdyrkelse. De tidlige calvinister var endda mistænksomme over for portrætter af gejstlige; Christopher Hales (som snart var en af de marianiske eksilerede) forsøgte at få portrætter af seks diviner sendt til sig fra Zürich, og han fandt det nødvendigt at forklare sine motiver i et brev fra 1550: “Dette er ikke gjort …. med henblik på at lave idoler af jer; de er ønsket af de grunde, som jeg har nævnt, og ikke af hensyn til ære eller veneration”.
Destruktionen var ofte yderst splittende og traumatisk inden for samfund, en umiskendelig fysisk manifestation, ofte pålagt ovenfra, som ikke kunne ignoreres. Netop derfor foretrak reformatorerne et enkelt dramatisk kup, og mange for tidlige handlinger i denne retning øgede kraftigt den efterfølgende fjendtlighed mellem katolikker og calvinister i lokalsamfundene – for det var som regel på by-, by- eller landsbyplan, at sådanne handlinger fandt sted, undtagen i England og Skotland.
Men reformatorer følte sig ofte drevet af stærke personlige overbevisninger, som det fremgår af sagen om Frau Göldli, som Zwingli blev bedt om at rådgive om. Hun var en schweizisk dame, som engang havde lovet den hellige Apollinaris, at hvis hun blev rask fra en sygdom, ville hun donere et billede af helgenen til et lokalt kloster, hvilket hun også gjorde. Senere blev hun protestantisk, og da hun følte, at hun måtte gøre det om, som hun nu betragtede som en forkert handling, gik hun hen til klosterkirken, fjernede statuen og brændte den. Hun blev retsforfulgt for blasfemi og betalte en lille bøde uden at klage, men nægtede blankt at betale det ekstra beløb, som retten havde pålagt klosteret at betale for at erstatte statuen, hvilket bragte hende i fare for alvorlige straffe. Zwingli rådede i sit brev til at forsøge at betale nonnerne et større beløb på betingelse af, at de ikke erstattede statuen, men det endelige resultat er ukendt. I slutningen af sit liv, efter at ikonoklastiske magtdemonstrationer var blevet et kendetegn for de tidlige faser af de franske religionskrige, blev selv Calvin foruroliget og kritiserede dem, da han indså, at de var blevet kontraproduktive.
Subjekter, der er fremtrædende i katolsk kunst ud over Jesus og begivenheder i Bibelen, såsom Maria og helgener, fik langt mindre vægt eller blev misbilliget i den protestantiske teologi. Som følge heraf holdt kirken i store dele af Nordeuropa praktisk talt op med at bestille figurativ kunst og lagde indholdet helt i hænderne på kunstnerne og de menige forbrugere. Calvinismen var endog imod ikke-religiøs begravelseskunst, som f.eks. den heraldik og de afbildninger, der var elsket af de rige i renæssancen. Hvor der var religiøs kunst, blev ikoniske billeder af Kristus og scener fra lidelsen mindre hyppige, og det samme gjaldt portrætter af helgener og gejstlige. Fortællende scener fra Bibelen, især i form af bogillustrationer og tryk, og senere moralistiske skildringer af det moderne liv blev foretrukket. Begge Cranachs malede allegoriske scener med lutherske doktriner, især en serie om lov og evangelium. Daniel Hisgen, en tysk rokokomaler fra det 18. århundrede i Oberhessen, specialiserede sig i cyklusser af bibelmalerier, der udsmykkede forsiden af galleribrynet i lutherske kirker med et øvre galleri, en mindre fremtrædende placering, der tilfredsstillede lutherske skrupler. Orgelkasser af træ blev også ofte malet med lignende scener som i katolske kirker.
Lutheranerne forsvarede kraftigt deres eksisterende hellige kunst mod en ny bølge af calvinistisk mod luthersk ikonoklasme i anden halvdel af århundredet, da calvinistiske herskere eller bymyndigheder forsøgte at påtvinge den lutherske befolkning deres vilje i den “anden reformation” fra ca. 1560-1619. Mod de reformerte udbrød lutheranerne: “Du sorte calvinist, du giver tilladelse til at smadre vores billeder og hugge vores kors; vi vil smadre dig og dine calvinistiske præster til gengæld”. Beeldenstorm, en stor og meget uordnet bølge af calvinistisk pøbelødelæggelse af katolske billeder og kirkeinventar, der spredte sig gennem Nederlandene i sommeren 1566, var det største udbrud af denne art, med drastiske politiske konsekvenser. Denne kampagne af calvinistisk billedstorm “fremkaldte reaktive optøjer fra lutherske folkemængder” i Tyskland og “gjorde de nærliggende ortodokse østlige naboer vrede” i Østersøområdet. Lignende mønstre som de tyske aktioner, men med tilføjelse af opmuntring og undertiden finansiering fra den nationale regering, sås i det anglikanske England under den engelske borgerkrig og det engelske Commonwealth i det næste århundrede, hvor der blev gjort mere skade på kunsten i middelalderlige sognekirker end under den engelske reformation.
En stor teologisk forskel mellem protestantisme og katolicisme er spørgsmålet om transsubstantiation, eller den bogstavelige forvandling af nadveroblaten og vinen til Kristi legeme og blod, selv om både lutherske og reformerte kristne bekræftede Kristi virkelige tilstedeværelse i eukaristien, førstnævnte som en sakramental forening og sidstnævnte som en pneumatisk tilstedeværelse. Protestantiske kirker, der ikke deltog i ikonoklasmen, valgte ofte som alterbilleder scener, der forestillede den sidste nadver, som alterbilleder. Dette hjalp gudstjenestedeltagerne til at huske deres teologi bag eukaristien, i modsætning til de katolske kirker, som ofte valgte korsfæstelsesscener til deres altertavler for at minde gudstjenestedeltagerne om, at Kristi offer og messens offer var et og det samme, via den bogstavelige transformation af eukaristien.
Den protestantiske reformation udnyttede også grafikkenes popularitet i Nordeuropa. Trykkeriet gjorde det muligt at masseproducere billeder og gøre dem bredt tilgængelige for offentligheden til en lav pris. Dette gav mulighed for en udbredt adgang til visuelt overbevisende billedmateriale. Den protestantiske kirke var derfor i stand til, som den katolske kirke havde gjort det siden begyndelsen af det 15. århundrede, at bringe deres teologi ud til folket, og religiøs undervisning blev bragt fra kirken og ind i almindelige menneskers hjem, hvorved der blev skabt en direkte forbindelse mellem de troende og det guddommelige.
Der blev også udkæmpet en voldsom propagandakrig, der til dels blev udkæmpet med populære tryksager fra begge sider; disse var ofte meget skurrile karikaturer af den anden side og deres doktriner. På den protestantiske side var portrætter af de ledende reformatorer populære, og deres portrætter forestillede undertiden apostlene og andre figurer i bibelske scener som f.eks. den sidste nadver.