Abstract

Ez a tanulmány a cinknek az elhízott patkányok termékenységét javító hatásának hátterében álló mechanizmust vizsgálja proteomikai módszerekkel. Három különböző dózisú ZnSO4 hatását vizsgáltuk a spermatogenezisre és a hormonszintekre. A here spermatogenezist HE-festéssel figyeltük meg. A szérum ösztrogén- és tesztoszteronszintet kemilumineszcens mikropartikuláris immunoassay-vel mértük. A spermium proteomikai elemzését folyadékkromatográfia-tömegspektrometriával végeztük. A DAVID adatbázist használtuk a GO-gazdagodási elemzés és a KEGG útvonalelemzés elvégzésére a differenciálisan expresszált génekről, a STRING online adatbázist pedig a PPI-hálózat felépítésére. A ZnSO4-kezelt patkányok csoportjának spermiumszáma, spermiummozgékonysága és tesztoszteron hormonjai megnövekedtek. A ZnSO4 javította a herék szerkezetét és az elhízás okozta spermatogenezis rendellenességeit. A proteomikai elemzés kimutatta, hogy 401 differenciálisan expresszált fehérje volt a ZnSO4-kezelt csoport és az elhízott csoportok összesen 6 spermamintájában. A differenciális fehérjéket bevittük a DAVID weboldalra. A 341 azonosított fehérjét ezután biológiai funkciójuk szerint osztályozták. A KEGG-elemzés azt mutatta, hogy a feldúsult jelútvonalak közé tartozott a glikolízis/glükoneogenezis, a szénanyagcsere, a citrátciklus, a zsírsav-anyagcsere és a piruvát-anyagcsere. Néhány fehérjéről kimutatták, hogy a valin, leucin és izoleucin lebontási útvonalakhoz kapcsolódik. A STRING-elemzés 36 csomóponti fehérjét kapott. A Cytoscape-elemzés azt mutatta, hogy ezek a fehérjék főként kilenc hálózatban vettek részt, beleértve az anyagcsere-folyamatot, az oxidáció-redukciót, az aerob légzést, az RNS-splicinget és a glutation-konjugációt. A ZnSO4 javíthatja az elhízott hím patkányok termékenységét az anyagcserével, gyulladással és spermiuméréssel kapcsolatos fehérjeexpresszió szabályozásával.

1. Bevezetés

Az elhízás összefüggésbe hozható a férfi meddőséggel. Van egy bizonyos időbeli konzisztencia a férfi meddőségi arány növekedése, a sperma minőségének csökkenése és az elhízás arányának növekedése között . Az elhízás a herék ultrastruktúrájának kóros elváltozásához vezet, és a spermatogén sejtek apoptózisa jelentősen megnövekszik . Az érett spermiumok számának csökkenése lehet az egyik ok, amely az elhízott emberek alacsony spermatogén képességéhez vezet.

Az elhízott embereknél nyomelem-anyagcserezavarok fordulnak elő. A nyomelem-anyagcsere zavart szintje a szervezetben megfelelő hatást vált ki a lipidanyagcserére. A férfi reproduktív rendszerben a cinkionok elsősorban a herében, a mellékherében, a prosztatában és az ondóban oszlanak el. A cink a prosztata működésének markere. Ezenkívül szabályozza a spermiumok működését, a legtöbb enzimatikus reakció kofaktoraként működik, és segít fenntartani a spermiumok mozgékonyságát. A cink a herék fejlődésében és a spermiumképződésben is fontos szerepet játszik . A cinkhiány jelentősen fokozza a csírasejtek apoptózisát az egér herében, és a spermatogenezis leállását és a megtermékenyülés károsodását okozza . Tanulmányok kimutatták, hogy az elhízott férfiaknál 3,5-szer nagyobb valószínűséggel fordul elő oligozoospermia, mint a normál testsúlyú férfiaknál . A cinkpótlás csökkentheti az elhízott emberek súlyát. A vércukorszint (éhgyomri vércukorszint), a vérzsírparaméterek (összkoleszterin, trigliceridszint, nagy sűrűségű lipoprotein koleszterin és kis sűrűségű lipoprotein koleszterin) és a vérnyomás javul a cinkpótlás után . Az orális cinkkészítmény javíthatja az ondóplazma cinktartalmát, elősegítheti a spermiummagfehérje átalakulását (azaz lizinről argininre), és gátolja a spermiummag korai depolimerizációját. Nyilvánvaló mellékhatások nélkül javíthatja a spermiumok mozgékonyságát és a terméketlen betegek spermiumminőségét . Azonban a proteomika alkalmazása a ZnSO4-kezelésnek a spermium fehérjékre gyakorolt hatásának megértésében elhízás esetén még mindig korlátozott, és további feltárásra van szükség.

Ebben a tanulmányban három különböző dózisú ZnSO4 hatását vizsgálták elhízott patkányok spermatogenezisére és hormonszintjére. Az e hatás hátterében álló mechanizmust proteomikai elemzéssel tovább elemeztük.

2. Anyagok és módszerek

2.1. Állatok

A 7 hetes Sprague Dawley patkányokat (súlyuk 180-200 g) a Hebei Orvosi Egyetem Kísérleti Állatközpontjából vásároltuk. 12 órás sötét/világos ciklusban tartották őket egy levegővel szabályozott helyiségben (hőmérséklet, ; páratartalom, ), szabad vízhez és állati takarmányhoz való szabad hozzáféréssel. Minden állatkísérleti eljárást a Hebei Családtervezési Tudományos és Technológiai Intézet etikai bizottsága hagyott jóvá.

2.2. Elhízásmodell létrehozása, az állatok csoportosítása és mintavételezése

A patkányokat véletlenszerűen két csoportra osztottuk: normál takarmányozási csoport (15 állat csoportonként) és elhízásmodell csoport (30 állat csoportonként). Mindkét csoportot 8 héten keresztül a megfelelő étrenddel etették, azaz normál takarmányt a normál csoportban és magas zsírtartalmú étrendet az elhízásmodell csoportban. A patkányok testtömegét hetente megmértük és 8 héten keresztül feljegyeztük. Az elhízási modellt akkor tekintettük sikeresnek, amikor a modellcsoport átlagos testtömege 1,2-szerese volt a kontrollcsoporténak. A patkányok hosszát megmértük (az orrhegytől a végbélnyílásig), és a Lee-indexet a következő képlettel számoltuk ki: .

Az elhízási modell felállítása után a modellpatkányokat véletlenszerűen két csoportra osztottuk: az elhízási csoportra és a ZnSO4-kezelt csoportra. A ZnSO4-kezelt csoportba tartozó patkányok 4 héten keresztül orális úton kaptak ZnSO4-et (Tianjin Yongda Chemical Reagent Company Limited) (3,2 mg/kg/d). A kísérlet végén megmértük az egyes csoportok testtömegét, heresúlyát, mellékheresúlyát és peritesztikuláris zsírszövetét, és vért vettünk a hasi aortából. A spermamintákat a caudalis mellékheréből vettük. A heréket eltávolítottuk.

2.3. Spermaszám és spermamotilitás

Minden patkány bal mellékheréjét közvetlenül az áldozathozatal után szedtük le, és 1 ml meleg (37 °C-os) sóoldatot tartalmazó csőbe helyeztük át. Ezután 37°C-on 5 percig rázogattuk őket, hogy a spermiumok szétszóródhassanak. Körülbelül 10 μL hígított spermiumszuszpenziót vittünk a hemocitométer minden egyes számláló kamrájába a spermiumkoncentráció és a motilitás meghatározásához. A motilitást a mozgékony spermiumok (a+b fokozat) százalékos arányaként mértük az összes spermiumon belül.

2.4. Az éhgyomri szérumglükóz, a vérzsírok és az inzulin meghatározása

A szérum teljes koleszterin, triglicerid, alacsony sűrűségű lipoprotein és magas sűrűségű lipoprotein szintjét Siemens Centaur XP analizátorral, kemilumineszcens mikropartikuláris immunoassay kit (Medical System Biotechnology Co., LTD) segítségével mértük. Az éhgyomri szérumglükózt egy glükóz kimutató készlettel (Medical System Biotechnology Co., Ltd., Ningbo, Kína) mértük ACCUTE TBA-40FR analizátoron (Toshiba Medical Systems Co., Tokió, Japán). Az inzulin szérumszintjét kemilumineszcens immunoassay-vel határoztuk meg UniCel DxI 800 rendszeren (Beckman Coulter, CA, USA), megfelelő reagensekkel (Beckman Coulter, CA, USA).

2.5. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

A leptinszintet ELISA-készletekkel (Multisciences Biotech Co., Ltd., Hangzhou, Kína) határoztuk meg. A reakció befejezése után az abszorbanciát 450 nm-en olvastuk le.

2.6. HE festés

A heréket Bouin-oldatban fixáltuk egy éjszakán át. Ezután a heréket alkohollal dehidratáltuk, majd paraffinba ágyaztuk. A mintákat 5 μm vastagságban metszettük és HE festéssel festettük. A here spermatogenezist fénymikroszkóp alatt figyeltük meg.

2.7. Androgénhormonok mérése

A szérum ösztrogén- és tesztoszteronszintjét Siemens Centaur XP analizátorral, kemilumineszcens mikropartikuláris immunoassay-vel mértük. A detektáló készletet a Siemens Healthcare Diagnostic Inc. és a Cayman Chemical, Michigan, USA-tól vásároltuk.

2.8. Folyadékkromatográfia-tömegspektrometria

A vizsgálatban használt spermiumfehérje-minták a három csoportból (normál csoport, elhízási modellcsoport és ZnSO4-kezelt csoport) származnak. A spermamintákat a caudalis mellékheréből szedtük le. Röviden, a fehérjéket 8 M karbamidot, 10 mM DTT-t és proteáz-inhibitort tartalmazó lizátpufferrel extraháltuk. A szonikációt 3-5 percig végeztük. A felülúszót 4°C-on 10 percig tartó 20000 g centrifugálás után gyűjtöttük össze, és a fehérjéket a Bradford-módszerrel számszerűsítettük. A kivont fehérjéket 100 mM TEAB-bal 100 μL-ig, majd 200 mM TCEP-vel inkubáltuk 55°C-on 1 órán keresztül, majd 5 μL 375 mM jodoacetamidot (IAA) adtunk hozzá. Miután 30 percig sötétben inkubáltuk, előhűtött acetont adtunk hozzá, majd egy éjszakán át -20°C-on inkubáltuk. A felülúszót a 10°C-on 10 percig tartó 8000 g centrifugálás után óvatosan eltávolítottuk, és a lizátumot 2-3 percig szobahőmérsékleten hagytuk száradni. Végül 100 μg fehérjét, 100 μL 100 mM TEAB oldatot és tripszin enzim arányú fehérjét (1 : 50) összekevertünk, és az enzimes emésztést egy éjszakán át 37°C-on végeztük.

Folyadékkromatográfia-tömegspektrometria: a részben emésztett mintákat vettük, és A oldatban (2% ACN/98% H2O/0,1% FA) oldottuk. Miután 30 percig 20000 g-nél centrifugáltuk, a felülúszót vettük, és a fehérjeszekvenciát EASY-nLC folyadékfázis-Q Exactive tömegspektrométerrel (amerikai Thermo Fisher) detektáltuk.

A tömegspektrometria feltételei: 90 perc adatgyűjtési idő, 2 kV permetezési feszültség, 320°C kapilláris hőmérséklet, 27% normalizált ütközési energia, 300-1400 Da gyűjtési tömegtartomány. Az elsődleges paraméterek a következők voltak: 70000 a felbontás, 36 az AGC-cél, 60 ms a maximális IT, és profil a spektrumadatok típusa. A másodlagos paraméterek a következők voltak: 17500 a felbontás, 54 az AGC-cél, 80 ms a maximális IT és 3,0 m/z az izolációs ablakhoz.

2.9. Adatkeresés

A MaxQuant 1.5.2.8 keresőmotorban az első hiba 20 ppm, a második hiba 0,02 Da. A rögzített módosítás a következő. A cisztein karbamidometil-Cys-re módosul, a változó módosítás pedig a következő: Oxidáció-M, LysisC vagy Trypsin, vagy Glu-C emésztés. Az enzimatikus emésztés legfeljebb 2 hiányzó helyet tesz lehetővé. Az adatok hézagkitöltését, normalizálását és a különbségek szűrését () a Perseus szoftver standard beállításainak használatával végeztük el. Összesen 1344 fehérjét azonosítottak és számszerűsítettek mindkét csoport 6 mintájában. Minőségi és mennyiségi információt kaptunk a Zn és a G csoport differenciális fehérjékről. A Perseus szoftver -vizsgálatot és szignifikanciaelemzést végzett a fehérjék mennyiségi eredményein és arányain. A kapott differenciális fehérjék listája a következő: összesen 401 szignifikáns differenciális fehérjét kaptunk a -test eredményei és a differenciális eloszláselemzés eredményei alapján.

2.10. GO (Gene Ontology) és KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) elemzés

A differenciális fehérjéket importáltuk a DAVID (Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis) weboldalra (https://david.ncifcrf.gov/) az alapvető bioinformatikai kinyeréshez. A DAVID által biztosított webes eszközökkel olyan funkcionális annotációs kifejezéseket és útvonalakat kerestünk, amelyek a fent azonosított fehérjékben feldúsultak, beleértve a sejtkomponenst, a molekuláris funkciót és a biológiai folyamatot.

2.11. Fehérjeinterakciós hálózatelemzés

A kiszűrt differenciális fehérjéket elemzés céljából importáltuk a STRING (https://string-db.org/) online adatbázisba. Megrajzoltuk a differenciális géninterakciós hálózattérképet. Az interaktív hálózati adatokat a Cytoscape 3.2 szoftverbe exportáltuk, hogy meghatározzuk a hálózat középponti csomópont fehérjét.

2.12. Statisztikai elemzés

Az adatokat . A statisztikai elemzést az SPSS22.0 programban végeztük el egyirányú varianciaanalízis (ANOVA) segítségével, ahol a < 0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük.

3. Eredmények

3.1. Az eredmények

3. Az ondó paramétereinek és a tesztoszteron hormon szintjének változása a spermában ZnSO4 kezelés után

A kontroll csoporttal összehasonlítva az elhízott csoport patkányainak testsúlya, peritesztikuláris zsír, Lee-index, összkoleszterin, triglicerid, nagy sűrűségű lipoprotein és leptin, valamint a ZnSO4 kezelt csoport patkányainak leptinje jelentősen megnőtt. A kontrollcsoporttal összehasonlítva az elhízott csoportba tartozó patkányok alacsony sűrűségű lipoproteinje jelentősen csökkent. Az elhízott csoporthoz képest a ZnSO4-kezelt csoportban csökkent a testsúly, a peritestiális zsír és a Lee-index, és a különbség statisztikailag szignifikáns volt (1. táblázat). A ZnSO4 patkányok termékenységére gyakorolt hatásának kimutatása érdekében a spermaparaméterek minden egyes csoportját először a WHO 2010-es kritériumai szerint értékeltük. A spermiumok száma és a spermiumok mozgékonysága gátolt volt az elhízott csoportban, amint azt a 2. táblázat mutatja. Az elhízott csoporttal összehasonlítva a ZnSO4-kezelt patkányok spermiumszáma és spermiummotilitása nőtt, ami arra utal, hogy a ZnSO4 javítja az elhízott patkányok spermaparamétereit. Az elhízás önmagában a vérzsírok emelkedését okozhatja, de eredményeink azt mutatták, hogy a vércukor-, vérzsír- és inzulinszintek nem érték el a cukorbetegség szintjét. Úgy tekinthető, hogy a diabéteszes szövődmények zavaró tényezőit kizártuk. Továbbá kimutattuk a szérum tesztoszteronszintet. Az eredmények azt mutatták, hogy a tesztoszteronhormonok emelkedtek a ZnSO4-kezelt csoportban az elhízott csoporthoz képest (2. táblázat). Így a ZnSO4-kezelés javíthatta az elhízott patkányok spermaminőségét.

3.2. táblázat. A ZnSO4-kezelés javítja az elhízás által okozott herekárosodás helyreállítását

Azt követően elvégeztük a hereszövet szövettani elemzését, és az eredményeket az 1. ábra mutatja. A here szövettani vizsgálata szerint a normál csoportban a spermatogenezis normális volt (1(a) és 1(d) ábra), míg az elhízott csoportban a spermatogenezis zavart mutatott, mivel a szemcsés tubulus lumenje szinte üres volt (1(b) és 1(e) ábra). Ahogy vártuk, a ZnSO4-kezelt csoport az elhízott csoporthoz képest jelentős javulást mutatott a here szövettanában, normális Sertoli- és Leydig-sejtek megjelenésével és zavartalan spermatogenezissel (1(c) és 1(f) ábra). Így a ZnSO4 javíthatja a herék szerkezetét és az elhízás okozta spermatogenezis rendellenességeit.

1. ábra

A herék keresztmetszeti morfológiája az egyes csoportok esetében (a-c) 40x és (d-f) 100x nagyításban HE festéssel: (a, d) normál csoport, (b, e) elhízott csoport és (c, f) ZnSO4-kezelt csoport.

3.3. 341 spermafehérje osztályozása bioinformatikai módszerrel: A differenciálisan expresszált fehérjék meghatározásához proteomikai elemzést végeztünk. Összesen 1344 fehérjét azonosítottunk és számszerűsítettünk összesen 6 spermamintában a ZnSO4-kezelt csoportból és az elhízott csoportból. A Perseus szoftver -vizsgálatot és differenciális szignifikanciaelemzést végzett a kvantitatív eredményeken és a fehérjék arányain. Összesen 401 szignifikáns fehérjét kaptunk. A differenciális fehérjéket bevittük a DAVID weboldalra a ZnSO4-kezelt csoport és az elhízott csoport fehérjefunkciójának különbségeire vonatkozóan. A GO osztályozásban 371 fehérjét elemeztünk, és 30 fehérje nem felelt meg. A 341 azonosított fehérjét ezután biológiai funkciójuk szerint osztályozták. A DAVID által biztosított webes eszközökkel olyan funkcionális annotációs kifejezéseket és útvonalakat kerestünk, amelyek a fent azonosított fehérjékben feldúsultak. Ezen elemzések eredményeit a 2. ábra mutatja be. A funkcionális annotációs terminusgazdagodási elemzéshez a sejtkomponens, a molekuláris funkció és a biológiai folyamat ontológiájára összpontosítottunk a és .

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

2. ábra

A spermában azonosított fehérjék funkcionális osztályozása és feldúsulása. A spermiumban azonosított összes fehérje GO-funkció szerinti osztályozásának elemzése a) sejtkomponens, b) molekuláris funkció és c) biológiai folyamat szerint. (d) A spermiumban lévő összes azonosított fehérje KEGG-útvonal dúsítási elemzése.

A “sejtkomponens” csoportban (2. ábra (a)) a kategóriaelemzés azt mutatta, hogy a jelentős különbségeket mutató fehérjék 59%-a organellakomponens, 60,7%-a pedig organellakomponens volt. Emellett a fehérjék 29,6%-a makromolekuláris komplexhez tartozott. A “molekuláris funkció” GO-terminus elemzése azt mutatta, hogy a fehérjék 22%-a katalitikus aktivitású fehérjéknek minősült (2. ábra b)). A többi fehérje a fehérjekötő, rRNS-kötő és enzimkötő kategóriába sorolható. A “biológiai folyamat” adatbázis szempontjából (2. ábra (c)) a 24% fehérjék többsége metabolikus folyamathoz kapcsolódott. Emellett fehérjék kapcsolódtak a szállításhoz, a jelátvitelhez, a sejthalálhoz, a sejtadhézióhoz, az immunrendszer folyamatához és a szaporodáshoz. A jelútvonal-elemzés eredményei (2. ábra (d)) a koncentrált fehérjékkel és a feldúsulással a következők. Több anyagcsere-útvonal, például a glikolízis/glükoneogenezis, a szénanyagcsere, a citrátciklus (TCA-ciklus), a zsírsav-anyagcsere és a piruvát-anyagcsere megzavarodott és érintett, és néhány fehérje a valin-, leucin- és izoleucinlebontási útvonalakhoz kapcsolódott

3.4. A cink hatását tovább azonosítják a differenciálisan expresszált spermafehérjék

A három csoport közötti fehérjeszintek összehasonlítására kvantitatív elemzést végeztünk. A differenciális fehérjék közül kiválasztottuk a metabolikus, a cink-transzporthoz kapcsolódó fehérjéket és a hálózat csomóponti fehérjéit (3. táblázat). A statisztikailag szignifikáns változásokat mutató fehérjéket a 3. ábrán mutattuk be. Ezek a fehérjék az ARG2, a COX5B, a ZNT1, a LYAR és a TM165 voltak. Az elhízott csoporthoz képest az ARG2, a COX5B és a ZNT1 expressziója a ZnSO4-kezelt csoportban szignifikánsan csökkent, míg a LYAR és a TM165 expressziója szignifikánsan nőtt.

Cluster Score () Nodes Edges Node 1 5.2 11 26 IDH3B, PMPCB, IDH3A, ATP5O, ATP5H, COX5B, ACADM, ACLY, LIPE, CPT1B, CPT1A IDS 2 5 5 10 HNRNPF, PRPF19, HNRNPU, HNRNPM, SRSF2 3 4 4 5 GSTM2, GSTM4, GSTM1, MGST 4 4 4 6 QSOX1, APLP2, NUCB1, LAMBB2 5 3.333 4 5 ADAM2, EQTN, ACR, PRM2 6 3 3 3 3 ANXA5, HPRT1, GGT1 7 3 3 3 3 ARF5, ASAP1, ARF2 8 3 3 3 SEC13, PAFAH1B1, XP01

3. táblázat

STRING fehérje kölcsönhatási hálózat csomópontjai.

3. ábra

A kvantitatív elemzés hat szignifikánsan kifejezett fehérjét mutatott ki. Ezek a fehérjék az ARG2, a COX5B, a ZNT1, a LYAR és a TM165. # a normál kontrollhoz képest; az elhízáshoz képest.

3.5. A differenciális fehérjeinterakciós hálózat létrehozása a STRING hálózati adatbázis segítségével

A STRING egy online elemző szoftver, amely elemzi és előrejelzi az ismert fehérjék közötti kölcsönhatásokat. A STRING szoftver pontozási mechanizmust hoz létre a különböző adatforrások megfelelő súlyozására, és végül átfogó pontszámot ad, majd felépíti a fehérje-fehérje kölcsönhatások hálózati térképét . A 341 kiszűrt differenciális fehérjét elemzés céljából importálták a STRING (http://string-db.org/) online adatbázisba, és 341 fehérjét azonosítottak, és létrehozták a differenciális géninterakciós hálózati térképet. Ezt követően az interaktív hálózati adatokat a Cytoscape 3.2 szoftverbe exportáltuk a hálózati központú csomópontfehérje meghatározásához. Látható, hogy a differenciális fehérjeösszetételű hálózat összetett (4. ábra). Ezután a Cytoscape plugin segítségével elemeztük a hálózat csomóponti fehérjéit, és az elemzésből összesen 36 csomóponti fehérjét kaptunk (3. táblázat). A STRING segítségével generált top hálózatok listájából kiválasztottuk az alhálózatokat. A Cytoscape-elemzés azt mutatta, hogy ezek a fehérjék főként kilenc hálózatban vettek részt, köztük az anyagcsere-folyamatokban, az oxidáció-redukcióban, az aerob légzésben, az RNS-splicingben és a glutation-konjugációban.

4. ábra

STRING fehérje kölcsönhatási hálózat. A kör a gént, a vonal pedig a gének közötti kapcsolatot jelöli.

4. Megbeszélés

A WHO meghatározása szerint a kóros vagy túlzott zsírfelhalmozódással rendelkező személy túlsúlyos vagy elhízott, és ez az állapot világszerte növekvő veszélyt jelent az emberek egészségére . Egyes jelentések azt mutatják, hogy az elhízás aránya gyorsan növekszik , ami nemcsak a betegségek kockázatát növeli, hanem ezzel párhuzamosan növeli a betegek reprodukciós rendellenességek kialakulásának kockázatát is. Mivel a férfiak reproduktív funkciója világszerte romlik , egyre többen felismerték, hogy az elhízás csökkenti az ondó minőségét. A BMI növekedésével az ondó paraméterei megváltoznak, így megváltozik a spermiumok fizikai és molekuláris szerkezete . Korábbi tanulmányok megállapították, hogy a spermiumkoncentrációt és a teljes mozgékony spermiumszámot károsan befolyásolta a magas BMI . A jelen vizsgálatban az elhízott csoportba tartozó patkányoknál a spermiumok koncentrációja és a spermiumok mozgékonysága jelentősen csökkent a normál testsúlyú csoporthoz képest, míg a ZnSO4 javította a spermium paramétereit az elhízott csoporthoz képest.

A nemi hormonok egyensúlyhiánya befolyásolhatja a férfi reprodukciót, és a túlsúlyos állapot befolyásolhatja a férfiak hormonszintjét . Ezzel egyidejűleg a vizsgálatok kimutatták, hogy az elhízás szorosan összefügg az endokrin rendellenességekkel, például a nemi hormonok rendellenességeivel . A férfiak elhízása negatív hatással van a férfi reprodukciós potenciálra a hormonszintek változásai miatt . Ezért minden csoportban megvizsgáltuk a szérumszinteket. A tesztoszteron hormonok emelkedtek a ZnSO4 kezelt csoportban a normál és az elhízott csoportokhoz képest. Úgy tűnik, hogy a ZnSO4-kezelés jelentősen megnövelte az androgénhormon-szinteket, hogy azok megfeleljenek a normál kontrollcsoport szintjének. A ZnSO4-kezelt patkányok csökkent testsúlya és vérzsírszintje javíthatja a Leydig-sejteket, ezáltal növelve a tesztoszteronszintet. Ennek következtében a hímivarsejtek funkcionális reproduktív rendszere regenerálódhat, segítve a spermatogenezist és a hereszerkezet regenerálódását . Nyilvánvaló, hogy a ZnSO4-kezelt csoport heréjének szövettana javult, a Sertoli- és Leydig-sejtek regenerálódtak, és a spermiumok a lumenben helyreálltak. Ezért a nagyszabású összehasonlító proteomika hatékony megközelítést nyújt az elhízott és a ZnSO4-kezelt csoportok közötti fehérjeexpressziós különbségek azonosítására. Tanulmányunk azonosította a normál termékeny spermiumok és a ZnSO4-kezelt csoportokból származó spermiumok fehérjeexpressziós profiljának különbségeit.

AGO annotációs elemzés kimutatta, hogy a fehérjék 24%-a metabolikus folyamatokhoz kapcsolódott, és a fehérjék 22%-a katalitikus aktivitású fehérjéknek minősült. A többi fehérje a fehérjekötő, rRNS-kötő és enzimkötő, beleértve az ATP-kötést is. Jól ismert, hogy az ATP-kötő fehérjék alapvető szerepet játszanak a biológiai folyamatokban, ami a szintetikus és metabolikus folyamatok változásaira utal. A mitokondriumok olyan organellumok, amelyek energiát (ATP-t) szolgáltatnak a sejtek számára. A mitokondriumok egyben az oxidatív stressz elsődleges célpontjai is. A férfi szervezetben a mitokondriumok a spermatogén sejtek érési folyamatában a fő energiaüzem, és az ejakuláció után a spermiumok számára is energiát biztosítanak. Ezért amikor az elhízott férfiaknál oxidatív stressz lép fel, a spermiumokban lévő mitokondriumok nagymértékben károsodhatnak. A spermium érzékeny az oxidatív stresszre, és nem képes a károsodások javítására. A magas zsírtartalmú étrend oxidatív stresszt indukál elhízott patkányokban, ami a spermiumok mitokondriális membránjának károsodását idézi elő, és befolyásolja a mitokondriális funkciót . Egwurugwu et al. arra a következtetésre jutott, hogy a cink-szulfát fiziológiás dózisokban jelentős pozitív hatást gyakorolt az androgén és a sperma minőségére. Nagyobb dózisokban azonban káros volt.

Az ARG2 ismert, hogy a mitokondriumokban lokalizálódik . Emellett döntő szerepet játszik az ornitin termelésében, amely a prolin, a hidroxiprolin és a poliamin előanyaga, és elengedhetetlen a sejtproliferációhoz. Az elhízást és a hozzá kapcsolódó betegségeket a krónikus gyulladás alacsony szintje jellemzi . Az ARG2 elősegíti a proinflammatorikus válaszokat a makrofágokban, és hozzájárul az ateroszklerózis és az elhízással összefüggő inzulinrezisztencia bizonyítékaihoz . Úgy véljük, hogy a korai elhízás az argináz upregulációjához vezethet, ami az argináz és az arginin metabolitok szisztémás változásait eredményezi. Az ARG2 felpregulációja az elhízott csoportban összefüggésbe hozható az elhízás okozta sejtproliferációval és krónikus gyulladással. Az argináz javítja az elhízás okozta májzsír- és szisztémás zsírtartalom-eltéréseket azáltal, hogy gátolja a máj triglicerid-anyagcserében és a mitokondriális működésben részt vevő útvonalak aktiválódását .

Ezek közül a fehérjék közül különösen a COX5B nagy érdeklődésre tart számot, amely a mitokondriális működéshez és a sejtek energiatermeléséhez kapcsolódik . A citokróm-oxidáz (COX, Complex IV) egy mitokondriális elektrontranszportlánc enzim, amely a mitokondrium belső membránjában található, és aktivitása szükséges a proton-motiváló erő létrehozásához, amely a downstream ATP-szintézist hajtja. A citokróm-oxidáz, azaz a mitokondriális légzési lánc IV. komplexének három mitokondriális izoformájának egyike. A COX5B részt vesz az oxidatív foszforiláció utolsó lépésében, a H2O termelésével és az ATP előállításához szükséges elektrokémiai gradiens fenntartásával. Így az ARG2 és a COX5B csökkent szintje a cink-szulfáttal kezelt patkányokban arra utalhat, hogy a cink által indukált hatás az elhízott patkányok termékenységére, különösen a herék regenerációjára, a spermatogenezisre és a spermiumok mozgékonyságára van hatással.

A jelen tanulmányban azonosított néhány differenciálisan expresszálódó fehérje részt vesz a cink transzport folyamatában. Például Elgazar és munkatársai megállapították, hogy a ZnT1 jelen van a támasztósejtek plazmamembránjában és citoplazmájában. A vizsgálatok kimutatták, hogy a Znt1 fontos szerepet játszik a cink homeosztázisban felnőtt egerekben . A fémre reagáló transzkripciós faktor-1 (MTF-1) szerepet játszik a fém homeosztázisra és az oxidatív stresszre adott sejtválaszok koordinálásában. Az MTF-1 egy cinkfüggő transzkripciós faktor, amely a cinkkoncentráció növekedésével stimulálja a metallothionein és a cink transzporter-1 (ZNT-1) géneket . Foster és munkatársai kimutatták, hogy a cink transzporter mRNS relatív expressziója nagyon változó. A ZnT1 a herében a legnagyobb mennyiségben fordul elő, és kölcsönhatása van a plazmamembránon keresztüli cinkszállításban. Noh és munkatársai arról számoltak be, hogy a ZnT1 mRNS szintje elhízott nőkben enyhén emelkedett, és a cink transzporter változásai az elhízással összefüggő gyulladásos állapotokkal is összefüggésbe hozhatók.

A Ly1 antitest reaktív homológot (LYAR) először Su és munkatársai írták le, mint egy cDNS-t kódoló cink ujj fehérjét, amelyet egér T-sejtes leukémiás vonalból izoláltak . A Lyar gén, amelyről ismert, hogy a herében bőségesen expresszálódik, egy nukleoláris fehérjét kódol, amely egy LYAR típusú C2HC cink-ujj motívumot és három nukleáris lokalizációs jelet tartalmaz. Lee és munkatársai megállapították, hogy a LYAR fehérje jelen van a spermatocitákban és spermatidákban, de a spermiumokban nem. Mi azonban kimutattuk a LYAR expresszióját a spermiumokban, és az expressziója csökkent az elhízott patkányok spermiumaiban, és nőtt a ZnSO4-kezelt csoportokban. A LYAR-t a citoplazmatikus riboszómákhoz kapcsolódóan azonosították a hímivarsejtekben és a rákos sejtekben, és részt vesz a preriboszomális RNS magon belüli feldolgozásában . A LYAR az emlős hímivarsejtekben és bizonyos daganattípusokban a transzláció beindulásának két alapvető lépése közül az egyiket modulálja . A LYAR jelentősen elnyomja az oxidatív stresszgének, köztük az SLC7A11, a HMOX1 és a CHAC1 transzkripcióját. A Myc onkoprotein felszabályozza a LYAR expresszióját a gén transzkripciójának aktiválásával, és a LYAR felszabályozása viszont védi a rákos sejteket az oxidatív stressz által közvetített apoptózissal szemben a CHAC1 gén expressziójának csökkentésén keresztül .

A 165 transzmembrán fehérje (TM165) egy Golgi transzmembrán fehérje , és hiánya veleszületett glikozilációs rendellenességet okoz. A TM165 mind transzkripcionálisan , mind transzlációsan felülreprezentált a hepatocelluláris karcinómában és összefügg a hepatocelluláris karcinóma invazív képességével . A közelmúltban végzett vizsgálatok során kapott adatok azonban több jelét adják a kalcium- és mangánhomeosztázisban való részvételének . A TM165 Ca2+ -t és Mn2+ -t szállít a Golgi-komplexbe H+ -ért cserébe a laktóz-szintáz és potenciálisan más glikoziltranszferázok működésének fenntartása érdekében . A TM165 humán Golgi fehérje képes kalciumot és mangánt szállítani élesztő- és baktériumsejtekben . Vizsgálatunk szerint a TM165 expressziója elhízott patkányokban csökkent és nőtt cinkpótlás után, ami arra utal, hogy a TM165 cinkpótlás után nőtt.

5. Következtetések

Végeredményben e tanulmány eredményei bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a ZnSO4 javíthatja a hormonszinteket, a herék regenerációját és a termékenységet. A proteomikai elemzés továbbá azt mutatja, hogy a ZnSO4 javíthatja az elhízott hím patkányok termékenységét az anyagcserével, gyulladással, spermiuméréssel és egyéb kölcsönhatásokkal kapcsolatos fehérjeexpresszió szabályozásával.

Adatok elérhetősége

A vizsgálat eredményeinek alátámasztására használt adatok kérésre rendelkezésre állnak.

Tájékoztatás

A támogató szervezetnek nem volt szerepe a vizsgálat tervezésében, az adatgyűjtésben és elemzésben, a közzétételről szóló döntésben vagy a kézirat elkészítésében.

Érdekütközés

A szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség a jelen tanulmány publikálásával kapcsolatban.

Köszönet

Ezt a tanulmányt a Hebei tartományi kormány által finanszírozott Klinikai Orvosi Kiváló Tehetségek Képzése és Alapkutatási Projekt (Grant No. 20170183) támogatta.