Abstract

Vizsgáltuk a vanádium-szulfát (VOSO4) 5 és 10 mg/kg-os kezelés hatását 30 napig a hasnyálmirigy endokrin aktivitására és szövettanára nem cukorbeteg és STZ-indukált cukorbeteg patkányokban. A diabéteszes csoportban a vércukorszint jelentősen emelkedett, míg az inzulinémia szintje jelentősen csökkent. A kezelés végén a VOSO4 10 mg/Kg dózisban normalizálta a vércukorszintet a diabéteszes csoportban, helyreállította az inzulinémiát és jelentősen javította az inzulinérzékenységet. A VOSO4 dózisfüggő módon növelte az inzulin-immunopozitív béta-sejtek számát a nem diabéteszes patkányok hasnyálmirigy-szigeteiben is. Továbbá az STZ-diabéteszes csoportban az inzulin immunpozitív béta-sejtek számának csökkenését elsősorban a nagyobb dózisú vanádiummal korrigálták a kontrollszint eléréséig. A VOSO4-kezelés tehát normalizálta a plazma glükóz- és inzulinszintjét és javította az inzulinérzékenységet STZ-kísérletes cukorbetegségben, valamint béta-sejtek proliferációját és/vagy regenerációját indukálta normál vagy diabéteszes patkányokban.

1. Bevezetés

A vánádium egy átmeneti fém. Becslések szerint évente több mint 60 ezer tonna kerül ebből az elemből a légkörbe az emberi tevékenység eredményeként, főként a fosszilis tüzelőanyagok elégetéséből .

A gyomor-bélrendszeren vagy a légutakon keresztül a keringési rendszerbe jutva a vanádiumvegyületek a transzferrin vagy ritkábban az albumin vagy a plazma alacsony molekulájú összetevői, például a citrátok és kisebb mértékben a laktátok vagy a foszfátok által szállítódnak . Számos vizsgálatot végeztek szervetlen és szerves vanádiumszármazékokkal indukált diabéteszes állatmodellekben, amelyekben a vizsgált vegyületek a glükóz-, koleszterin- és trigliceridszintet befolyásolták, és hosszabb ideig tartó adagolás esetén nem voltak jelentős káros mellékhatások . Számos kísérletet végeztek cukorbetegeken is, amelyek megerősítették a vanádiumvegyületek vércukorszintre gyakorolt terápiás hatását, kevés toxikus hatás mellett .

A vanádiumról (beleértve a vanadilt és a vanadátot) kimutatták, hogy csökkenti a vércukorszintet a glikogenezis, a glükózfelvétel és az anyagcsere serkentésével, valamint a máj glükoneogenezisén és glikogenolízisen keresztül történő glükózképződés gátlásával . Megállapították, hogy a vanádium és a vanádiumvegyületek inzulinszerű aktivitást mutatnak az inzulin hatását imitálva az inzulinreceptor tirozinkináz aktivációs és kináz foszforilációs kaszkád útvonalakon keresztül . Ezért a vanadil-szulfátot terápiás szerként javasolták az 1. típusú cukorbetegség kezelésére . A sztreptozotocin (STZ) kezelés elpusztítja a hasnyálmirigy béta inzulintermelő sejtjeit, és az STZ-indukált cukorbeteg patkányokat az 1-es típusú diabetes mellitus modelljének tekintik. Bár a vanádiumvegyületekről kimutatták, hogy antidiabetikus tulajdonságokkal rendelkeznek az STZ-indukált diabéteszes modellben, hatásmechanizmusuk jelenleg még vizsgálat alatt áll. A tanulmány célja az volt, hogy megvizsgáljuk a vanádium-szulfáttal végzett 30 napos kezelésre adott válaszokat nem diabéteszes és STZ-indukált diabéteszes patkányoknál.

2. Anyagok és módszerek

2.1. VANÁDIUMSZULFÁTOK Diabéteszes patkányok előkészítése

Az állatokat 0,01 M citrát pufferben (pH 4,5) 65 mg/Kg egyszeri dózisú STZ intraperitoneális injekcióval (ip) tettük diabéteszessé. Ezt az ip módszert választottuk a közelmúltbeli jelentések alapján, amelyek kifejezett glükóznövelő hatást mutattak ki STZ-diabéteszes patkányokban .

2.2. Állatok és kezelés

A tunéziai Pasteur Intézettől vásárolt, 5-6 hetes (175-200 g súlyú) hím Wistar patkányokat a tunéziai egyetem helyi etikai bizottságának az állatok felhasználására és gondozására vonatkozó ajánlásaival összhangban használták fel, az NIH ajánlásainak megfelelően. Ad libitum táplálékot (standard pellet-táplálék-Badr Utique-TN) és vizet kaptak, és ketrecenként öt egyedet tartottak ketrecenként összegyűjtött hőmérsékleten (22 °C), 12 órás világos-sötét ciklusban. A patkányokat hat csoportra osztottuk.

Az 1. csoport a nem diabéteszes kontroll állatok (ND kontroll) voltak, és naponta intraperitoneális injekciót (ip) kaptak NaCl 9. A 2. és 3. csoport ND volt, és naponta 5, illetve 10 mg VOSO4/Kg dózist kapott (ND + 5 mg/Kg és ND + 10 mg/Kg) 30 napon keresztül. A 4. csoport diabéteszes kontroll (D-kontroll) volt, amely egyszeri 65 mg/Kg STZ-adagot kapott. Az 5. és 6. csoportot az STZ-diabéteszes állatok alkották, amelyeket 30 napon keresztül 5 vagy 10 mg/Kg VOSO4-mal kezeltek (D + 5 mg/Kg, D + 10 mg/Kg). Az STZ-csoportokat 48 órával az STZ-indukált cukorbetegség után kezelték VOSO4-gyel.

2.3. Biokémiai vizsgálatok

A glikémia glükómmérővel (ACCU-CHEK-Active Roche) történő meghatározása előtt minden állatot 12 órával koplaltattunk. Az inzulinérzékenységet 1 U/Kg inzulin ip beadása után mértük, és a vércukorszintet 2 órán keresztül 30 perces időközönként határoztuk meg a hormonszint százalékában .

Az állatokat az utolsó kezelés után 24 órával feláldoztuk, majd vért vettünk és a szérumot feldolgoztuk az inzulin becsléséhez, amelyet Elisa kit (BioVendor által forgalmazott) segítségével határoztunk meg.

2.4. Az állatok vércukorszintjének meghatározása. Immunhisztokémiai értékelés

Az inzulin immunhisztokémiai festését a Langerhans-szigetek béta-sejtjeinek integritásának jellemzésére végeztük. Ehhez a csoportok közötti összehasonlításhoz a Langerhans-szigetek maximálisan nagyobb felületét mutató szöveti metszeteket választottuk ki. A metszeteket először paraffinmentesítettük, fokozatosan csökkenő etanol-sorozaton keresztül hidratáltuk, 40 percre tampon-citrátba (pH 6) merítettük, majd 50 mM Tris-HCl, pH 7,6-ban (DAKO) hígított poliklonális tengerimalac anti-insulin antitesttel inkubáltuk. Mosás után a metszeteket foszfatázkonjugált tengerimalac-ellenes antitesttel inkubáltuk, és a feltárási eljárást TechMate 500 gép segítette. Végül a metszeteket hematoxilinnal/eozinnal festettük.

Patkányonként tíz hasnyálmirigy-szigetsejtet vizsgáltunk mikroszkóp alatt, és az inzulinpozitív és inzulinnegatív sejtek számát a sejtmagok számozásával számoltuk meg. Az adatokat az inzulin-immunpozitív sejtek százalékában/az egyes szigetek összes sejtjének számában fejeztük ki.

2.5. Statisztikai elemzés

A különböző csoportok közötti különbségek szignifikanciáját egyirányú varianciaanalízissel (ANOVA), majd Tukey többszörös összehasonlító teszttel értékeltük, és az értéket szignifikáns szintnek tekintettük.

3. Eredmények

A VOSO4-kezelés hatását a vércukorszintre nem diabéteszes (ND) és diabéteszes (D) patkányokban az 1. ábra mutatja. A kontroll ND csoportban a kezelés során nem volt szignifikáns változás a vércukorszintekben (1. ábra (a)). Az ND patkányok 5 vagy 10 mg/Kg VOSO4-mal történő kezelése nem változtatta meg szignifikánsan a vércukorszintet az első 10 nap alatt. A vércukorszint azonban a kezelés végén az 5 mg/Kg dózissal szignifikánsan csökkent, és a 10 mg/Kg dózissal a 15. és 30. nap között szignifikánsan csökkent a kontroll ND csoporthoz képest. A 30. napon a glikémia csökkenése körülbelül 8, illetve 15% volt az 5 és 10 mg/Kg dózisok esetében a kontrollcsoporthoz képest. Mint gyanítható volt, az STZ-vel kezelt kontroll patkányoknál a vércukorszint jelentős emelkedése volt megfigyelhető a kezeletlen állatokhoz képest ( versus mg/dl), ami a cukorbetegség telepítését jelzi, amely az egész kísérlet során fennmaradt. A diabéteszes csoport (D) 5 mg/Kg VOSO4-mal történő kezelése a 10. naptól kezdve jelentősen csökkentette a vércukorszintet, míg a 10 mg/Kg-os adag az 5. naptól kezdve jelentősen és fokozatosan csökkentette a vércukorszintet, hogy a 30. napra elérje a normál szintet. A 30 napon jegyzett glikémiás értékek a D + 5, a D + 10 és a kontroll D csoportokban a és versus mg/dl voltak (1. ábra b)).

Az 1. táblázat az ND és a D csoport inzulinszintjét mutatja a VOSO4-kezelés nélkül és azt követően. Az 5 mg/Kg VOSO4-mal kezelt ND patkányok inzulinszintje nem mutatott szignifikáns változást, de 10 mg/Kg-mal jelentős emelkedést értek el a kontroll ND csoporthoz képest ( versus µg/L). Sőt, a kontroll D csoportban az inzulinémia mélyen csökkent a kontroll ND állatokhoz képest ( versus µg/L). A VOSO4 beadása a D csoportokban dózisfüggő módon jelentősen növelte az inzulinémiát. Valójában az inzulinszintek a diabéteszes patkányokban 5 mg és 10 mg/Kg dózisokkal 5 mg és µg/L-re, illetve µg/L-re emelkedtek.

Az inzulinérzékenység változását az inzulin (1 U/Kg) ip injekcióját követően a normál és a cukorbetegséggel kezelt állatokban a 2. ábra mutatja. ND patkányoknál a 10 vagy 5 mg VOSO4-mal történő kezelés nem változtatta meg az inzulin beadására adott glikémiás profilt (2. a) ábra). Valóban, ezekben a csoportokban az inzulin maximális hipoglikémiás hatása 60, illetve 90 percre volt megfigyelhető, és körülbelül a kezdeti glikémiás értéknek felelt meg. A VOSO4 alacsony dózisával kezelt diabéteszes állatok hasonló glikémiás profilt mutattak, mint a kontroll D csoport, a maximális csökkenés 60 percre következett be, míg a magas dózissal kezelt állatoknál a glikémia jelentős () és gyors maximális csökkenése az inzulin beadása után 30 perccel következett be (2. ábra (b)).

A VOSO4 kezelt csoportokban a hasnyálmirigy-szigetsejtek mérete nagyobbnak bizonyult a megfelelő kontroll ND és D csoportokhoz képest (3. és 4. ábra). A statisztikai elemzések azt mutatták, hogy a VOSO4 kezelések az inzulin immunopozitív sejtek számának jelentős növekedését idézték elő, körülbelül 20%-kal az ND + 5 és 27%-kal az ND + 10 mg/Kg csoportokban (5. ábra). A VOSO4-kezelés az STZ-diabéteszes csoportokban dózisfüggő módon jelentősen, 12, illetve 23%-kal növelte az inzulin-immunopozitív sejtek számát 5 és 10 mg/Kg dózisokkal (5. ábra). Az STZ-diabéteszes kezelt csoportok és az ND kontroll patkányok közötti összehasonlítás nem mutatott szignifikáns különbségeket.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

5. ábra

Vanadil-szulfát hatása a béta-sejtek számára %-ban. Az értékek átlag ± SD-t jelentenek. ; versus ND kontroll. ; versus D kontroll. versus D + 5 mg/Kg. Patkányonként 10 szigetsejtet elemeztünk.

4. Megbeszélés

A vanádium antidiabetikus tulajdonságait vizsgáltuk a vércukor- és inzulinszintre, valamint az endokrin hasnyálmirigy B-sejtjeire gyakorolt hatásának feltárásával.

STZ-indukált diabéteszes patkányok felhasználásával kimutattuk, hogy a vanadil-szulfát (VOSO4) 5 és 10 mg/Kg-os kezelése szignifikánsan csökkentette az átlagos vércukorszintet a 10., illetve az 5. napra a kezeletlen kontrollcsoporthoz képest. A 30. napon a nagyobb dózisú vegyületet kapott diabéteszes patkányok hasonló glikémiaszintet mutattak, mint az ND kontroll állatok. Az ND patkányoknál azonban a VOSO4 alacsonyabb dózisával történő kezelés nem változtatta meg jelentősen a vércukorszintet, míg a magasabb dózis a kezelés 15. napjára kis mértékű és fokozatos csökkenést idézett elő, és a 30. napra a glikémia körülbelül 14%-kal csökkent. Eredményeink összhangban vannak a korábbi adatokkal, amelyek azt mutatják, hogy a vanádiumvegyületek orális beadása STZ-indukált vagy genetikailag öröklött vagy táplálkozási diabéteszes állatokban jelentősen javította a hiperglikémiát . Embereknél Soveid és munkatársai beszámoltak az orális vanadil-szulfát terápia biztonságosságáról és hatékonyságáról 30 hónapos időtartam alatt 1-es típusú cukorbetegeknél az inzulinszükséglet és a vércukorszint csökkentésével.

A mi vizsgálatunk is kimutatta, hogy a VOSO4 hipoglikémiás hatását a cukorbeteg csoportban a bazális inzulinémia szintjének jelentős emelkedése kísérte dózisfüggő módon. A 10 mg-os dózissal a diabéteszes patkányok inzulinémiaszintje csaknem normalizálódott. Valójában a vércukorszint különösen a vanádiumvegyületnek kitett diabéteszes patkányoknál regisztrált csökkenése összefügghet a plazma inzulin koncentrációjának egyidejű növekedésével. Ezek az eredmények összhangban voltak a vanádiumvegyületek hatékonyságára vonatkozó korábbi adatokkal a diabéteszes állapot javításában .

Továbbiakban vizsgáltuk a vanádium adagolásának hatását az inzulinérzékenységre diabéteszes és nem diabéteszes patkányokban. Az ND csoportokban az inzulin maximális hipoglikémiás hatását a hormonbevitelt követő 60-90 percben mutattuk ki. A D csoportokban azonban a 10 mg-os dózisú VOSO4-kezelés fokozta az inzulinérzékenységet a vércukorszint gyorsabb és kifejezettebb csökkenésével a hormon beadását követően, míg az 5 mg-os dózis nem változtatta meg jelentősen a D patkányok glikémiás válaszát. A VOSO4 által kiváltott jobb inzulinérzékenység összhangban van számos olyan vizsgálattal, amelyek azt mutatják, hogy a vanádiumot különböző szövetekben erős inzulin mimetikus vagy inzulintrofikus hatásúnak lehet tekinteni .

Bebizonyosodott, hogy a vanádiumvegyületeket többféle hatásmód jellemzi, amelyek vércukorcsökkenést eredményeznek . In vivo és in vitro vizsgálatok arról számoltak be, hogy a vanadil-szulfát fokozta a glükóztranszportot és az anyagcserét a vázizmokban, a májban és a zsírszövetekben . Az ortofoszfát-anionokhoz való szerkezeti hasonlóságuknak köszönhetően a szerves vanádiumszármazékok gátolják a fehérje-foszfotyrozin-foszfatázt . Gátolják az inzulinreceptor defoszforilációjáért felelős enzim, a PTP-1B aktivitását is, ami inzulinrezisztenciát okoz . A vércukorszint vanádiumvegyületek általi csökkentésének másik mechanizmusa a PKB/Akt-kináz aktiválása, ami a GLUT4 transzporter általi glükózfelvétel növekedéséhez vezet . A PKB/Akt aktiválása serkenti a GSK3 foszforilációját is, ami a glikogénszintézis serkentését eredményezi . Másrészt megállapították, hogy a C-jun N-terminális kináz gátlása javítja az inzulinérzékenységet kísérleti cukorbetegségben .

A vánádium növeli a glükóztranszportot és az oxidációt, valamint az inzulinreceptor tirozin-kináz aktivitást, és inzulin-szerű hatást fejt ki a glükóz- és lipidanyagcserére inzulinfüggő vagy inzulinfüggetlen biokémiai utakon keresztül .

Tudott, hogy az STZ-kezelés elpusztítja a hasnyálmirigy-szigetsejtek béta-sejtjeit, ami inzulinfüggő diabetes mellitust idéz elő . Így ebben a vizsgálatban kimutattuk a hasnyálmirigy-szigetsejtek területének csökkenését, ami az inzulinra immunreaktív béta-sejtek számának jelentős csökkenésével társult a cukorbeteg csoportban a nem diabéteszes kontroll állatokhoz képest. Azonban mind az ND, mind a D csoportban a VOSO4-kezelés megnövelte a hasnyálmirigy-szigetsejtek méretét a megfelelő kontrollcsoportokhoz képest. A legfontosabb, hogy a diabéteszes patkányok VOSO4-kezelése dózisfüggő módon növelte az inzulin-immunopozitív béta-sejtek számát a kezeletlen diabéteszes csoporttól eltérően, ami arra utal, hogy a VOSO4 képes béta-sejteket generálni az STZ-indukált diabéteszes patkányokban. Valójában az 5 és 10 mg VOSO4-mal kezelt diabéteszes patkányok szigetsejtjeiben a béta-sejtek száma nem különbözött szignifikánsan az ND csoportétól. Ez összhangban van a vegyület hasnyálmirigy inzulinotróp tulajdonságára vonatkozó korábbi vizsgálatokkal . Érdekes módon a vanádium kezelés a nem diabéteszes patkányok szigeteiben is jelentősen növelte a béta-sejtek számát.

A hasnyálmirigy alloxán-perfundált szegmensének egérmodelljében Waguri és munkatársai a béta-sejtek extra-szigeti prekurzor sejtekből történő regenerációs folyamatairól számoltak be. Valóban, STZ-diabéteszes patkányokban a VOSO4-kezelés serkentheti a béta-sejtek proliferációját a szigeten belüli endokrin sejtekből és a differenciálódást a szigeten kívüli prekurzor sejtekből.

Végeredményben a jelen tanulmány azt mutatja, hogy a vanadil-szulfát hasznos lehet, mint potenciális antidiabetikus szer. Mivel azonban a jelenlegi bizonyítékok még mindig korlátozottak és főként állatmodelleken alapulnak, valamint keveset tudunk a vanádiumvegyületek terápiás formuláiról és mellékhatásairól, további vizsgálatokra van szükség a diabéteszes betegek hagyományos terápiájaként való hosszú távú alkalmazásukkal kapcsolatban.

Érdekütközések összeférhetetlensége

A szerzők kijelentik, hogy e cikk publikálásával kapcsolatban nem áll fenn érdekellentét.

Köszönet

Ezt a munkát a Tunéziai Felsőoktatási és Tudományos Kutatási Minisztérium támogatta.