3.53.4.3 Szintetikus fágterápia
A bakteriofágok, vagy egyszerűen csak fágok, központi szerepet játszottak a molekuláris biológia és a bakteriális genetika fejlődésében, és a DNS-molekulák rekombinációjának legkorábbi eszközeit, például a restrikciós enzimeket és ligázokat biztosították. Az elmúlt évtizedben a fágrezisztencia-mechanizmusok tanulmányozása a PCR óta az SB egyik legfontosabb alaptechnológiájának felfedezéséhez vezetett; ez a CRISPR nukleázrendszer, amelyet a baktériumok és az archaikusok az exogén DNS-sel szembeni adaptív védekezésként fejlesztettek ki. A közelmúltban azonosított számos más, korábban nem jellemzett antifág rendszer további áttörést jelentő technológiákat biztosíthat az SB alkalmazások számára.45 Ebben a történelmi kontextusban tehát helyénvaló, hogy az SB-t most a fágokra alkalmazzák, hogy tökéletesítsék terápiás hatóanyagként való felhasználásukat.
A fágokat egymástól függetlenül Frederik Twort és Félix D’Hérelle fedezte fel a 20. század elején46,47 , és nem sokkal később antimikrobiális hatóanyagként alkalmazták olyan fertőző betegségek kezelésére, mint a kolera és a pestis. Kelet-Európában a fágterápia általánossá vált, és számos neves kezelőközpont létezik a mai napig, például Grúziában és Lengyelországban. Nyugaton a kezdeti szórványos sikerek után a fágterápia az antibiotikumok széles körű elterjedésével elhalványult. Napjainkban az antimikrobiális szereknek ellenálló kórokozók – kezdetben az úgynevezett ESKAPE-törzsek48 , de ma már a kórokozók még szélesebb köre49 – terjedésével, amelyek az előrejelzések szerint 2050-re több halálesetet fognak okozni, mint a rák, újra megnőtt az érdeklődés a fágterápia iránt.
A fágok alkalmazása számos előnnyel jár az antibiotikumokkal szemben, elsősorban azzal a lehetőséggel, hogy specifikus törzseket célozhatnak meg, és ezáltal érintetlenül hagyhatják a hasznos mikrobiális közösséget, valamint azzal a képességgel, hogy a rezisztenciát kiegészítő fágkoktélok alkalmazásával, a kiválasztott gazdatörzseken történő “kiképzéssel” vagy egyszerűen új fágok izolálásával le lehet győzni egy kórokozó ellen. Ezzel szemben számos akadályt kell leküzdeni és fejlesztésre váró terület van ahhoz, hogy a fágterápia megbízható gyógyszerré váljon és széles körben elterjedjen Nyugaton, mint például: erős klinikai vizsgálatok megfelelő kontrollokkal, a megfelelő gazdaszervezeti tartományban lévő fágok azonosításához szükséges idő csökkentése, a fágrezisztencia leküzdése és a céltörzs kizárási mechanizmusai anélkül, hogy komplex koktélokra lenne szükség, a fágrészecskékre adott nemkívánatos immunválaszok megkerülése és az antibiotikum-rezisztencia gének vagy bakteriális virulenciafaktorok általános átvitelének visszaszorítása. Még a céltörzs sikeres elpusztítása esetén is a nagyszámú baktérium gyors lízise és az ezzel együtt járó endotoxinok és szuperantigének felszabadulása erős gyulladásos választ és kedvezőtlen klinikai kimenetelt eredményezhet.
A fággenomok rendkívül moduláris szerveződése és a fágszerkezet funkcionális modulokká, például farokrostokká, tüskékké, farokcsövekké és kapszidokká történő összeállítása a fágokat ideális célpontokká teszi az SB megközelítések számára, bizonyos értelemben a fággenomok már BioBricksbe szerveződnek. A jövőbeli szintetikus fágtervezés egyik korai sablonjaként a Pf3 fonalas fágot módosították a Pseudomonas aeruginosa fertőzés egérmodellben történő kezelésére50. A Pf3 egyik exportfehérje génjét a BglII restrikciós endonukleázt kódoló génre cserélték, azzal az érveléssel, hogy (1) ez a géncsere a Pf3-at nem-replikatívvá teszi, ezáltal bevezetve egy elszigetelési stratégiát, (2) a fág stabilan szaporítható a BglII metiláz gént tartalmazó gazdában, és (3) a BglII katalizálná a kettős szálszakadást a céltörzs genomi DNS-ében az elpusztítás érdekében. A vizsgálat fontos eredménye volt, hogy a fertőzött egerek kezelése a Pf3R módosított fággal vagy egy lítikus fággal hasonló túlélési esélyt adott a 3-as minimális letális dózissal megfertőzött egerek esetében, de az 5-ös minimális letális dózisnál a túlélési arány jelentősen jobb volt a Pf3R fágterápiával. A szérum citokinszintek elemzése csökkent gyulladásos választ jelzett, ami arra utal, hogy a Pf3R kezelési csoport jobb kimenetele a céltörzs hatékony, lízis és endotoxin felszabadulás nélküli elpusztításának köszönhető.
A P. aeruginosa Pf3R általi elpusztítása a fág gazdaszervezetének tartományára támaszkodik a célzás specifitásának biztosítása érdekében, mivel a BglII restrikciós helyek várhatóan lényegében minden baktérium genomban jelen vannak. Javulást sugall egy olyan bakteriofág figyelemre méltó felfedezése, amely egy ismeretlen forrásból származó CRISPR/Cas rendszert kapott saját használatra.51 A fág által kódolt CRISPR/Cas rendszer képes új spacereket szerezni, és a CAS3 nukleázt egy olyan kromoszómaelemre irányították át, amelyet gazdája, a Vibrio cholera a veleszületett immunitáshoz használ. E felfedezést követően a Streptococcus pyogenesből származó II. típusú CRISPR rendszert az M13 bakteriofágba olyan spacereket építettek be, amelyek az Escherichia coli antibiotikum-rezisztencia és virulencia gének szekvenciáit célozzák meg, a szerzők ezeket az eszközöket RNS-vezérelt nukleázoknak (RGN) nevezik.52 E rendszer kiváló specificitását demonstrálva egy RGN képes volt diszkréten elpusztítani egy olyan törzset, amely a DNS-girázban egy nukleotid-polimorfizmust hordozott, amely kinolon-rezisztenciát kölcsönöz. Továbbá, egy három baktériumtörzsből álló mesterséges konzorciumban képesek voltak elpusztítani a kiválasztott törzseket (400-20 000-szeres pusztítás a kontrollokhoz képest), miközben a konzorcium többi tagját érintetlenül hagyták. A CRISPR/Cas által közvetített pusztítás specificitása a fágterápiát a kórokozók célzott kezelésén túl kiterjesztheti az emberi mikrobiom pontos módosítására, amelynek összetételét egyes rákos megbetegedések, sőt olyan neurológiai rendellenességek prognózisában is szerepet játszanak, mint az autizmus, a Parkinson-kór és az Alzheimer-kór a bél-agy tengelyen keresztül.
Az ideális szintetikus fágplatform olyan lehet, amelyben a gazdaszervezethez való kötődést úgy alakították ki, hogy az nagyon széles legyen, míg a törzsek célzott specifitását a CRISPR/Cas hasznos teher biztosítja. Ily módon a fágokat könnyen be lehetne vetni a kezelésekhez, anélkül, hogy minden egyes kórokozóhoz ad hoc új platformot kellene izolálni. Továbbá a széles gazdaszervezeti tartomány a több antibiotikum-rezisztencia- vagy virulencia-gént célzó CRISPR-tömbökkel kombinálva lehetővé tenné a preszumptív, azaz a kórokozó azonosítását megelőző fágterápia alkalmazását. A gazdatartomány-bővítési stratégiák közé tartoznak a fágreceptorok és a szükséges gazdafaktorok azonosítására irányuló forward genetikai szűrések,53 a profág receptorkötő fehérje (RBP) szekvenciák bányászata bakteriális genomokból és szintetikus fágok újraindítása, amelyek például receptorkötő fehérje RBP könyvtárakat kódolhatnak a HTS számára54,55. A receptorok kapszulák általi maszkolása leküzdhető exopoliszacharid-hidrolizáló enzimek56 és más, biofilmeket lebontó enzimek57 expressziójával, míg más maszkoló mechanizmusok és a receptorok expressziójának fázisváltozása leküzdhető több, különböző RBP-t tartalmazó farokszállal vagy nem kanonikus, magasan konzervált sejtfelszíni célpontokhoz tartozó RBP-kkel módosított fágokkal. A baktériumok számos fágellenes rendszert alkalmaznak, amelyek közül az elsők a restrikció-módosítás veleszületett immunitása és a CRISPR/CAS adaptív immunitása, de fordítva, a fágok is több stratégiát fejlesztettek ki e rendszerek legyőzésére, például nem kanonikus nukleotidokat használnak a DNS-ükben, kevesebb restrikciós résszel rendelkeznek vagy hipermetilálják a genomjukat, és olyan fehérjéket szállítanak, amelyek gátolják a restrikciós enzimeket vagy fokozzák a gazdaszervezet metiláló enzimjeit.
Az itt leírt szintetikus fágplatformmal elkerülhető lenne a fágkoktélok szükségessége, amelyek szabályozási jóváhagyása bonyolultabb lehet. A fágmérnökség fennmaradó célpontjai számos biotermék esetében általánosak, mint például a stabilitás és az immunrendszer válasza. Különösen a fagocita sejtek felelősek a fágrészecskék kiürítéséért a keringési rendszerből. A hosszú ideig keringő fágmutánsokat sorozatos passzázs technikával58 nyerték, és azt találták, hogy a fő kapszidfehérje mutálódott. Később egy közvetlen genetikai manipulációval bevezetett, szintén a kapszidfehérjében lévő egyetlen aminosavváltozást követően a fág 13 000-16 000-szeresére nőtt a fágnak az egér keringési rendszerében való megmaradási képessége59. A fágok mint terápiás szerek javítását célzó egyéb paraméterek, mint például a termelés, a formulázás és a beadás módja valószínűleg kívül esnek az SB tevékenységein, de a natív fágokkal végzett korábbi munkák tanulságai az SB által módosított fágokra is vonatkoznak.
Az elmúlt évtizedben a fágterápia iránti megújult érdeklődés és a sikeres egyedi beteges esetekről szóló szórványos jelentések miatt kísérleteket tettek ellenőrzött klinikai vizsgálatok lefolytatására, amelyek nem eredményeztek jelentős mellékhatásokat, de a hatékonyságot még mindig nem sikerült határozottan bizonyítani. A több mint 100 évvel ezelőtt kezdődött fágterápia történetének izgalmas következő cikke lesz, hogy az SB által módosított fágok klinikai vizsgálatokba kerüljenek.