A Botulinum neurotoxin tulajdonságai és kimutatása
A clostridiumok többféle fehérjetoxint termelnek, mint bármely más mikroorganizmus nemzetség. A Clostridium botulinum kiemelkedő tulajdonsága, hogy rendkívüli hatású neurotoxint képes szintetizálni. A BoNT-k farmakológiailag hasonló toxinok egy családját alkotják, amelyek a perifériás kolinerg szinapszisokhoz kötődnek és blokkolják az acetilkolin exocitózist a neuromuszkuláris csomópontokban. A BoNT-k az élelmiszerekben, a bélben és a kultúrában termelődnek progenitor toxinkomplexek formájában, amelyek nem mérgező fehérjékhez társuló botulinális neurotoxinból állnak. Kimutatták, hogy a komplexek nem toxikus összetevői stabilitást kölcsönöznek a neurotoxinnak, és megakadályozzák a bélben lévő emésztőenzimek általi inaktiválást.
A botulizmus diagnózisa általában a betegek klinikai tüneteinek értékelésével történik, élelmiszerrel terjedő járványok esetén pedig a közös ételt fogyasztó emberek egy csoportját érintő esetek csoportosulásával. A botulizmus legtöbb vizsgálata során az elsődleges cél a BoNT jelenlétének kimutatása, mivel a C. botulinum spórái széles körben elterjedtek a környezetben, és számos élelmiszert szennyeznek. A BoNT kimutatása a vérben, a gyomortartalomban és az élelmiszerben megerősíti a botulizmus tényét. A C. botulinum izolálása gyanús élelmiszerből, botulizmus tüneteket mutató csecsemők székletéből vagy sebből alátámasztja a botulizmus diagnózisát. Ez azonban a legtöbb esetben nem nyújt megerősítést, mivel a spórák megtalálhatók az élelmiszerekben és alkalmanként egészséges felnőttek székletében is.
A BoNT kimutatása lehetőleg az élelmiszerből vagy klinikai mintából kivont toxin biotesztjével történik. A kivonatot intraperitoneálisan befecskendezik egerekbe, és az állatokat rendszeresen megfigyelik a botulizmus tipikus jeleiért legfeljebb négy napon keresztül. A jelen lévő BoNT mennyiségétől függően a botulizmus tünetei általában 4-24 órán belül jelentkeznek. A jellegzetes tünetek közé tartozik az állatok csökkent mozgékonysága, a szőrzet fodrozódása, légzési nehézség, a hasi izmok összehúzódása, ami “darázs” morfológiát eredményez, majd görcsök és halál. Az ezeket a tüneteket mutató állatok általában 24-48 órán belül elpusztulnak. Azokat az állatokat, amelyek 2 óránál hamarabb vagy 48 óra elteltével pusztulnak el, úgy kell tekinteni, hogy a BoNT-től eltérő anyagoknak estek áldozatul. A BoNT okozta halált szerotípus-specifikus antitoxinokkal történő semlegesítéssel lehet megerősíteni.
A BoNT klinikai mintákból és bizonyos élelmiszerekből származó egér biotesztek során gyakran fordulnak elő komplikációk. Különösen gyakoriak a nem botulinummal interferáló anyagok által okozott halálesetek. Ezek a nem specifikus halálesetek általában elkerülhetők a zavaró halálos anyag olyan végpontig történő hígításával, ahol a halált a hatásosabb BoNT okozza. Előfordulhat, hogy egynél több BoNT-szerotípus van jelen az elemzett mintában, és a megerősítéshez az antitoxinok keverékével történő semlegesítésre van szükség. Élelmiszerek vagy klinikai minták esetében a nem botulinumos halálozás fertőzés vagy endotoxinok jelenléte miatt következhet be. A fertőző ágensek eltávolíthatók membránszűréssel vagy antibiotikumok hozzáadásával a vizsgált kivonathoz. Az endotoxinokat tartalmazó kivonatok általában megfelelő végpontig hígíthatók, vagy az endotoxinok adszorpcióval eltávolíthatók. A C. botulinum nem proteolitikus törzseiből (II. csoport) származó kivonatok esetében a toxicitást növeli a proteázzal, például tripszinnel történő aktiválás. Egyes élelmiszerekben a tripszin toxikus peptideket hozhat létre, ezért a reakciót 30-60 perc elteltével szója tripszin inhibitor hozzáadásával le kell állítani.
A C. botulinum élelmiszerből izolálható megfelelő táptalajban, például főtt hús-glükóz levesben vagy peptonokat, élesztőkivonatot és glükózt tartalmazó táptalajban történő dúsítással. A C. botulinumnak összetett tápanyagigénye van, és a növekedéshez gazdag táptalajra van szüksége. Az izoláláshoz gyakran hasznos az élelmiszer vagy a klinikai minta egy részét 80 °C-on vagy 60 °C-on melegíteni, hogy az I. és II. csoportba tartozó C. botulinum spórákat kiválasszuk. Esetenként 50%-os etanolt használnak a vegetatív sejtek inaktiválására a II. csoportú C. botulinumra vizsgált élelmiszermintákban. A dúsítást követően a BoNT jelenlétét a korábban leírtak szerint egér bioteszttel vizsgálják. Az I. csoportú C. botulinum klinikai mintákból történő izolálására antibiotikumokat – többek között cikloserin, szulfametoxazol és trimetoprim – tartalmazó szelektív izolációs agarokat használtak.
A BoNT kimutatására számos immunológiai módszert fejlesztettek ki, de a legtöbbjük nem olyan érzékeny, mint az egér bioteszt, és az is hátrányuk lehet, hogy biológiailag inaktív BoNT-t mutatnak ki. Számos előrelépés történt az enzimhez kötött immunoszorbens tesztek (ELISA) terén, hogy enyhítsék ezeket a hátrányokat, és valószínű, hogy az ELISA-t az egér bioteszt kiegészítésére, de nem helyettesítésére fogják használni.