A nem kompetitív inhibitor olyan inhibitor, amely csak az enzim-szubsztrát komplexhez kötődik. Kötőhelye csak akkor alakul ki, ha az enzim és a szubsztrát kölcsönhatásba lépett egymással. A nem kompetitív gátlás nem működik, ha további szubsztrátokat próbálnak bevonni. Az enzim-szubsztrát-inhibitor komplex nem termel terméket
E + S -> ES
ES + I -> ESI -X-> E + P
Kompetitív inhibitor kötődik az enzim-szubsztrát komplexhez, hogy megakadályozza az enzim reakcióját a szubsztráttal termék képződéséhez, mint ilyen, jól működik magasabb szubsztrát- és enzimkoncentrációknál, hogy a szubsztrátok az enzimhez kötődnek; a kötődés következtében csökken az enzimhez kötődő szubsztrát koncentrációja, a Km és a Vmax, és nő az enzim szubsztráthoz való kötődési affinitása.
E + I -> (S-en keresztül) ES + I -> E + P
melyben E az enzim, I az inhibitor, ES az enzim-szubsztrát komplex és P a termék.
A szubsztrát megkötése módosítja az enzim szerkezetét, így az inhibitor-kötőhely elérhetővé válik. A nem kompetitív gátlás csökkenti a maximális sebességet és a KM-et is. K,M a szubsztrát koncentrációja, amikor a sebesség a Michaelis-Menten kinetikai modell alapján a maximális sebesség fele. Mind a Vmax, mind a KM azonos mértékben csökken. A Vmax akkor is csökken, ha az enzim-szubsztrát kötődés fokozódik, mert ESI-komplexek képződnek. Az ESI-komplexek gátolják a termék képződését. Egy nem kompetitív inhibitor csökkenti a KM-et és jobb enzim-szubsztrát kötődést hoz létre, mert csak az ES komplexhez kötődik. Az ES-komplex azonban folyamatosan kimerül, ahogy az inhibitor kötődik, ESI-komplexeket hozva létre. Ezért az ES és ESI komplexek közötti egyensúly fenntartása érdekében és Le Chatelier elvét követve a reakció a több ES képződés irányába tolódik el, ahol több szubsztrátot köt az enzimhez, így több ES keletkezik. Ez végső soron alacsonyabb KM-hez vezet. A csökkent KM jobb enzim-szubsztrát kötődést jelez, mivel az enzim kisebb szubsztrátkoncentráció mellett is eléri maximális sebességének felét. Bizonyos értelemben az enzim-szubsztrát kötődés nagyon hatékony, mivel az enzim és a szubsztrát nagy affinitással rendelkezik, és erősen kölcsönhatásba lép egymással.