A csatorna zsilipjei a Chagres és más folyók által táplált Gatún, Alajuela és Miraflores tavakból származó víz gravitációs áramlásával működnek. Maguk a zsilipek egyforma hosszúak, szélesek és mélyek, és párban épültek, hogy lehetővé tegyék a hajók egyidejű áthaladását mindkét irányban. Minden zsilipkapunak két, 20 méter (65 láb) széles és 2 méter (6,5 láb) vastag, zsanérokra szerelt szárnya van. A kapuk magassága 46 és 82 láb (14 és 25 méter) között változik; mozgatásukat a zsilip falába süllyesztett elektromos motorok hajtják. A zsilipeket egy vezérlőtoronyból működtetik, amely az egyes zsilippárokat elválasztó falon található, és ahonnan a zsilipkamrák megtöltését vagy kiürítését is irányítják. A zsilipkamrák 1000 láb (300 méter) hosszúak, 110 láb (33 méter) szélesek és 40 láb (12 méter) mélyek.
Stan Shebs
Az eredeti zsilipmechanizmusok kényes volta miatt a zsilipeken csak kis hajók haladhatnak át segítség nélkül. A nagyobb hajókat elektromos vontatómozdonyok vezetik, amelyek a zsilip falán lévő fogaskerekeken működnek, és arra szolgálnak, hogy a hajókat a zsilipben középen tartsák. A zsilipbe való behajózás előtt egy, a megközelítési falak között kifeszített védőláncon kell áthaladni. Ha minden rendben zajlik, ez a lánc a csatorna alján lévő horonyba kerül. Ha a hajó véletlenül túl gyorsan halad a biztonság érdekében, a lánc kifeszítve marad, és a hajó nekifut. A lánc, amelyet a falakban lévő hidraulikus gépezet működtet, ezután automatikus kioldással lassan kienged, amíg a hajó meg nem áll. Ha a hajó elszabadulna a vontató mozdony elől, és a láncot áttörve nekimegy az első kapunak, egy 15 méterre lévő második kapu védi a zsilipet, és megállítja a további haladást.
A 2007-ben megkezdett Harmadik zsiliprendszerek projekt harmadik zsiliprendszereit a belgiumi Antwerpenben található Berendrecht-zsilip és a németországi csatornákon használt víztakarékos medencék ihlették. A zsilipkamrák építéséhez az atlanti és a csendes-óceáni oldalon mintegy 190 000 tonna, főként Mexikóból származó acél van erősen vasbetonba ágyazva, az új zsilipkapuk pedig akár 33 láb (10 méter) szélesek, 98 láb (30 méter) magasak és 190 láb (58 méter) hosszúak. Az új kamrákat és medencéket, amelyek a Gatún-tóból áramló vizet fogják szabályozni, úgy tervezték, hogy minimalizálják a víz áramlásának turbulenciáját és az áthaladó hajók zavarását. A medencék 2016 júniusában készültek el, és 158 szelepet tartalmaznak, amelyek 20 000 tonna szerkezeti anyagból állnak. A tisztviselők szerint ezek a víztakarékos medencék a legnagyobbak a világon, és megkönnyítik a víz 60 százalékos újrafelhasználását. Míg a meglévő zsilipek 52 millió gallon (197 millió liter) vizet használnak minden egyes használat során, addig az új zsilipek 48 millió gallon (182 millió liter) vizet használnak.