3.53.4.3 Synthetic Phage Therapy
I batteriofagi, o semplicemente chiamati fagi, hanno giocato un ruolo centrale nello sviluppo della biologia molecolare, della genetica batterica e fornendo i primi strumenti per ricombinare molecole di DNA, come gli enzimi di restrizione e le ligasi. Nell’ultimo decennio lo studio dei meccanismi di resistenza dei fagi ha portato alla scoperta di una delle più importanti tecnologie abilitanti per la SB dopo la PCR: i sistemi nucleasi CRISPR, che batteri e archei hanno evoluto come difesa adattativa al DNA esogeno. La recente identificazione di numerosi altri sistemi antifagici precedentemente non caratterizzati può fornire ulteriori tecnologie innovative per le applicazioni della SB.45 In questo contesto storico è giusto che la SB sia ora applicata ai fagi per perfezionare il loro uso come agenti terapeutici.
I fagi furono scoperti indipendentemente da Frederik Twort e Félix D’Hérelle nella prima parte del XX secolo46,47 e subito dopo furono utilizzati come agenti antimicrobici per trattare malattie infettive come il colera e la peste. Nell’Europa dell’Est la terapia fagica divenne comune e diversi centri di trattamento rinomati esistono ancora oggi, per esempio, in Georgia e in Polonia. In Occidente, dopo alcuni sporadici successi iniziali, la terapia fagica scomparve dall’uso quando gli antibiotici divennero ampiamente disponibili. Oggi, con l’aumento degli agenti patogeni resistenti agli antimicrobici, inizialmente i cosiddetti ceppi ESKAPE48 , ma ora un insieme ancora più ampio di agenti patogeni49 che si prevede causeranno più morti del cancro entro il 2050, c’è un rinnovato interesse nella terapia fagica.
L’uso dei fagi ha diversi vantaggi rispetto agli antibiotici, in primo luogo il potenziale di colpire ceppi specifici e quindi lasciare intatta la comunità microbica benefica, e anche la capacità di superare la resistenza attraverso l’uso di cocktail di fagi complementari, “addestrando” i fagi su ceppi ospiti selezionati o semplicemente isolando nuovi fagi contro un patogeno. Al contrario, ci sono diversi ostacoli da superare e aree di miglioramento perché la terapia fagica diventi una medicina affidabile e ampiamente adottata in Occidente, come: forti studi clinici con controlli adeguati, riducendo il tempo per identificare i fagi con la gamma di ospiti appropriati, superando la resistenza fagica e i meccanismi di esclusione del ceppo bersaglio senza la necessità di cocktail complessi, aggirando le risposte immunitarie indesiderate alle particelle fagiche e il contenimento della trasduzione generalizzata di geni di resistenza antibiotica o fattori di virulenza batterica. Anche nel caso di un’uccisione riuscita di un ceppo bersaglio, la rapida lisi di un gran numero di batteri e il concomitante rilascio di endotossine e superantigeni possono provocare una forte risposta infiammatoria e un esito clinico sfavorevole.
L’organizzazione altamente modulare dei genomi fagici e l’assemblaggio della struttura fagica come moduli funzionali, come fibre di coda, punte, tubi di coda e capside, rende i fagi obiettivi ideali per approcci SB, in un certo senso i genomi fagici sono già organizzati in BioBricks. In un primo modello per la progettazione di futuri fagi sintetici, il fago filamentoso Pf3 è stato modificato per trattare l’infezione da Pseudomonas aeruginosa in un modello murino.50 Un gene della proteina di esportazione di Pf3 è stato sostituito con un gene che codifica l’endonucleasi di restrizione BglII, con il ragionamento che (1) questa sostituzione genica rende Pf3 non replicativo introducendo così una strategia di contenimento, (2) il fago può essere propagato stabilmente in un ospite contenente il gene metilasi BglII e (3) il BglII catalizzerebbe rotture a doppio filamento nel DNA genomico del ceppo bersaglio per l’uccisione. Una scoperta importante di questo studio è stata che il trattamento di topi infetti con il fago ingegnerizzato Pf3R o con un fago litico ha dato una sopravvivenza comparabile per i topi sfidati con una dose letale minima di 3, ma ad una dose letale minima di 5 il tasso di sopravvivenza era significativamente migliore con la terapia fagica Pf3R. L’analisi dei livelli di citochine nel siero ha indicato una risposta infiammatoria ridotta che indica che il risultato migliore per il gruppo di trattamento Pf3R è dovuto all’uccisione efficiente del ceppo bersaglio senza lisi e rilascio di endotossina.
L’uccisione di P. aeruginosa da Pf3R si basa sulla gamma ospite fago per fornire specificità di targeting come siti di restrizione BglII dovrebbe essere presente in essenzialmente tutti i genomi batterici. Un miglioramento è suggerito dalla notevole scoperta di un batteriofago che ha ottenuto un sistema CRISPR/Cas, da una fonte sconosciuta, per il proprio uso.51 Il sistema CRISPR/Cas codificato dal fago è in grado di acquisire nuovi spaziatori e la nucleasi CAS3 è stata ritargettizzata a un elemento cromosomico che il suo ospite, Vibrio cholera, usa per l’immunità innata. In seguito a questa scoperta, il sistema CRISPR di tipo II dello Streptococcus pyogenes è stato ingegnerizzato nel batteriofago M13 con spaziatori per bersagliare sequenze di resistenza agli antibiotici e geni di virulenza in Escherichia coli, gli autori si riferiscono a questi dispositivi come nucleasi guidate dall’RNA (RGN).52 Dimostrando la squisita specificità di questo sistema, un RGN è stato in grado di uccidere in modo discriminante un ceppo che ospitava un polimorfismo a singolo nucleotide nella DNA gyrase che conferisce resistenza al chinolone. Inoltre, in un consorzio artificiale di tre ceppi batterici sono stati in grado di uccidere ceppi selezionati (400-20.000 volte rispetto ai controlli) lasciando intatti gli altri membri del consorzio. La specificità dell’uccisione mediata da CRISPR/Cas potrebbe espandere la terapia fagica oltre il targeting degli agenti patogeni per una precisa modulazione dei microbiomi umani, la cui composizione è stata implicata nella prognosi di alcuni tumori e persino nei disturbi neurologici come l’autismo, il Parkinson e l’Alzheimer attraverso l’asse intestino-cervello.
Una piattaforma fagica sintetica ideale potrebbe essere quella in cui il legame con l’ospite è progettato per essere molto ampio mentre la specificità del targeting del ceppo è fornita dal carico utile CRISPR/Cas. In questo modo i fagi potrebbero essere prontamente impiegati per i trattamenti, senza che una nuova piattaforma debba essere isolata ad hoc per ogni patogeno. Inoltre, l’ampia gamma di ospiti combinata con gli array CRISPR che mirano a diversi geni di resistenza agli antibiotici o di virulenza potrebbe consentire l’uso di una terapia fagica presuntiva, cioè prima dell’identificazione del patogeno. Le strategie di estensione dell’ospite includono schermi genetici in avanti per identificare i recettori dei fagi e i fattori dell’ospite necessari,53 l’estrazione di sequenze di proteine leganti i recettori dei fagi (RBP) dai genomi batterici e il riavvio di fagi sintetici che potrebbero, per esempio, codificare librerie di proteine leganti i recettori RBP per HTS.54,55 Il mascheramento dei recettori da parte delle capsule può essere superato esprimendo enzimi idrolizzatori di esopolisaccaridi56 e altri enzimi per degradare i biofilm57 , mentre altri meccanismi di mascheramento e la variazione di fase nell’espressione dei recettori possono essere superati da fagi ingegnerizzati con diverse fibre di coda contenenti diverse RBP o RBP a bersagli di superficie cellulare non canonici altamente conservati. I batteri utilizzano numerosi sistemi anti-fago, i principali sono l’immunità innata di restrizione-modificazione e l’immunità adattativa di CRISPR/CAS, ma al contrario i fagi hanno contro-evoluto molteplici strategie per sconfiggere questi sistemi come l’uso di nucleotidi non canonici nel loro DNA, avendo meno siti di restrizione o ipermetilando i loro genomi e fornendo proteine che inibiscono gli enzimi di restrizione o migliorano gli enzimi metilanti dell’ospite.
La piattaforma fagica sintetica qui descritta eviterebbe la necessità di cocktail di fagi per i quali l’approvazione normativa può essere più complessa. Gli obiettivi rimanenti per l’ingegneria fagica sono generici per molti biologici, come la stabilità e la risposta del sistema immunitario. Le cellule fagocitiche in particolare sono responsabili della rimozione delle particelle fagiche dal sistema circolatorio. Fagi mutanti a lunga circolazione sono stati ottenuti con una tecnica di passaggio seriale58 e sono stati trovati mutati nella proteina del capside principale. In seguito, un singolo cambiamento di aminoacido, sempre in una proteina del capside, introdotto mediante manipolazione genetica diretta, ha portato a un aumento da 13.000 a 16.000 volte della capacità del fago di rimanere nel sistema circolatorio del topo.59 Altri parametri per migliorare i fagi come agenti terapeutici, come la produzione, la formulazione e la via di somministrazione probabilmente non rientrano nell’ambito delle attività di SB, ma le lezioni apprese dal precedente lavoro con i fagi nativi si applicheranno anche ai fagi ingegnerizzati SB.
Nell’ultimo decennio, con il rinnovato interesse per la terapia fagica e sporadiche segnalazioni di casi di successo di singoli pazienti, ci sono stati tentativi di eseguire studi clinici controllati che non hanno portato a significativi effetti avversi, ma l’efficacia non è stata ancora dimostrata in modo enfatico. Sarà un prossimo entusiasmante articolo della storia della terapia fagica, iniziata oltre 100 anni fa, per vedere i fagi ingegnerizzati SB entrare negli studi clinici.